Lung microsomal p-nitrophenol hydroxylase-characterization and reconstitution of its activity

Abstract

ÖZET AKCİ?ER MICROZOMAL p-NITROFENOL HIDROKSİLAZ ENZİMİNİN KARAKTERİ ZASYONÜ VE AKTiViTESiNiN YENİDEN OLUŞTURULMASI AYDO?MUS, Aydan Yüksek Lisans Tezi, Biyokimya Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Emel Arınç Eylül 1988 Benzen ve nitrobenzenden katekol oluşumu bu maddelerin karsinojenik aktivitelerine bağlandı. Karaciğerde, p- nitrobenzenin bir ara ürünü olan p-nitrofenol, ensimatik yoldan 4-nitrokatekole dönüşür. Bu çalışmada ilk olarak p-nitrofenolün, 4- nitrokatekole dönüşümünü katalize eden ve aktivitesi oldukça yüksek olan enzimin varlığı koyun akciğerinde tesbit edildi ve maksimum aktivite için optimum koşullar incelendi. Enzimin pH optimumu 6.8 olarak bulundu. p-Nitrofenol hidroksilasyon hızının 1 mi inkübasyon ortaminda 2 mg'a kadar çıkan protein miktarı ile doğru orantı vererek arttığı saptandı. Maksimum 4-nitrokatekol oluşum hızı, 0.25 roM p-nitrofenol konsantrasyonunda gözlendi. p-Nitrofenol hidroksilaz enziminin özgül aktivitesi akciğer mikrozomlarında 0.494 nmol 4-nitrökatekol/mg protein/dakika olarak bulundu. Lineweaver-Burk ve Eadie-Hofstee grafiklerinin eğri hatlı olduğu saptandı. Lineweaver-Burk grafiğinden K değerleri 11.6 mve 71.4 nM ve Eadie-Hofstee graf ilinden ise K değerleri 10.7 m ve 74.5 mM olmak üzere akciğer p-nitrofenol hidroksilaz enzimi için iki K değeri hesaplanmıştır.Bu grafiklerden elde m edilen eğriler, akciğer mikrozomlarmda, p-nitrofenolün orto hidroksilasyonunda rol oynayan iki ayrı enzimin veya iki ayrı konformasyonda bulunan bir enzimin varlığını düşündürmektedir Koyun akciğer p-nitrofenol hidroksilas aktivitesinin, çözünürleştirilmiş akciğer sitokrom P-450, MDPH-sitokrom P- 450 redüktaz ve sentetik lipit fosfatidil kolin dilauroyl bulunan bir ortamda yeniden oluşturulması ile, akciğer p- nitrofenol hidroksilaz enziminin karışık fonksiyonlu oksidazlar veya sitokrom P-450'ye bağımlı roonooksijenazlar olarak tanınan enzim sisteminin bir üyesi olduğu gösterildi. vi

ABSTBACT LUNG MICROSOMAL p-NITROPHENOL HYDROXYLASE - CHARACTERIZATION AND RECONSTITDTION OF ITS ACTIVITY AYDO?MÜŞ, Aydan M. S in Biochemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Emel Armç September 1988 Formation of catechols from benzene and nitrobenzene have been implicated in the carcinogenic activity of these chemicals. In liver, p-nitrophenol, intermediate of p- nitrobenzene, is enzymatically converted to 4-nitrocatechol. First time in this study, the presence of a highly active enzyme catalyzing the formation of 4-nitrocatechol from p-nitrophenol was detected in lung microsomes. In addition the optimum conditions for sheep lung microsomal p- nitrophenol hydroxylase were established. The maximal activity was noted at pH 6.8. The rate of p-nitrophenol hydroxylation was linear up to 2 rog protein/ml of incubation mixture. The maximal rate of 4-nitrocatechol formation was observed with 0.25 mM p-nitrophenol. The average specific activity of lung p-nitrophenol hydroxylase was 0.494 nmoles 4-nitrocatechol formed/mg protein/min. The Lineweaver-Burk and Eadie-Hofstee plots were found to be curvilinear. Two different K values were calculated as 11.6 and 71.4 iaM from m Lineweaver-Burk plot and as 10.7 and 74.5 nM from Eadie- iiiHofstee plots. This suggested that there were either two forms of enzyme or two different enzymes participitating in ortho hydroxylation of p-nitrophenol in lung microsomes. Lung microsomal p-nitrophenol hydroxylase activity of sheep was reconstituted in the presence of purified lung microsomal cytochrome P-450, NADPH-cytochrome P-450 reductase and synthetic lipid, phosphatidylcholine dilauroyl, suggesting that lung p-nitrophenol hydroxylase is a member of the enzyme system known as microsomal mixed-function oxidases or cytochrome P-450 dependent microsomal monooxygenases. iv