Klorprifos-etil`in karaciğerde neden olduğu oksidatif hasarın invitro şartlarda araştırılması

Abstract

40 ÖZET Klorprifos-etil (KE), yaygın olarak kullanılan organofosfat insektisitlerden biridir. Bu çalışmada, KE'in insan karaciğer hücre dizisi HepG2 üzerine sitotoksik etkisini ve melatonin koruyucu etkisini araştırdık. Çalışma iki aşamada gerçekleştirildi. İlk aşamada hücre canlılığına KE'nin etkisi ve bunun engellenmesinde melatoninin rolü araştırıldı. Bu aşamada gruplar şu şekilde organize edildi: 1. Kontrol grubu (KE grubunun canlılık oranlan bu gruba göre değerlendirildi.) 2. Melatonin grubu (Mel+ KE grubunun canlılık oranlan bu gruba göre değerlendirildi.) 3. KE grubu (Değişik dozlarda KE ile muamele edildi.) 4. Mel+ KE grubu (Değişik dozlarda KE'ye ek olarak melatonin eklendi.) Hücreler 96 well petri kaplarına her well'de 3x1 05 olacak şekilde ekildi. 24 saat sonra KE grubundaki hücreler (1080, 540, 270, 135, 67.5, 33.7, 16.8, 8.4, 4.2, 2.1, 1 ve 0.5 ng/ml) konsantrasyonlarında KE ile 72 saat 37 °C'de %5 C02 'li ortamda (Lee inkübatörde) inkübe edildiler. Melatonin+KE grubundaki HepG2 hücreleri ise bir saat 500 u,g/ml melatonin ile ön inkübasyona alındıktan sonra değişen KE konsantrasyonlan ile 72 saat muamele edildiler. Daha sonra KE ve KE+M gruplarında hücre canlılığı belirlendi. KE verilen HepG2 hücrelerinin canlılığı kontrol grubundaki hücrelere oranla anlamlı derecede düşük bulundu. KE'nin sitotoksisitesi KE konsantrasyonuna bağlı olarak azaldı (p<0.05). Buna ek olarak melatoninle bir saat inkübe edildikten sonra KE uygulanan HepG2 hücrelerinin canlılığı melatonin uygulanmayan gruba göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0.05). Çalışmanın İkinci aşamasında ise melatoninin etki tarzını açıklamaya yönelik çalışmalar yapıldı. Bu aşamada ise gruplar şöyle organize edildi: 1. Kontrol grubu (Yalnızca besi yeri verildi) 2. Mel grubu (Yalnızca melatonin verildi) 3. K 67.5 grubu (Hücrelere 67.5 ug/ml KE verildi) 4. Mel+K 67.5 grubu (Hücrelere melatonin ve 67.5 p.g/ml KE verildi)41 5. K540 grubu (Hücrelere 540 ug/ml KE verildi) 6. Mel+K 540 grubu (Hücrelere melatonin ve 540 ug/ml KE verildi) Bu gruplarda hücre dizilerinde uygun büyüme sağlandıktan sonra iki gün 500 Ug/ml melatonin eklenerek sonra üçüncü gün ilgili gruplara 67.5 ve 540 ug/ml KE verildi. Dördüncü gün deney sonlandırıldı ve hücre homojenatlarında tiobarbütirik asit reaktif substan (TBARS) düzeyleri ile süperoksid dismutaz (SOD), GSH-Px (glutatyon peroksidaz) ve katalaz aktiviteleri tayin edildi. KE verilmesi HepG2 hücre dizilerinde SOD, GSH-Px ve katalaz aktivitelerinde anlamlı azalmalara neden olurken lipid peroksidasyonunun son ürününün bir göstergesi olan TBARS düzeyini anlamlı olarak artmıştır (p<0.05). KE uygulanmasından önce melatonin eklenmesi ise artmış TBARS düzeyini azaltırken, GSH-Px ve katalaz aktivitelerindeki düşüşleri anlamlı olarak artırmıştır (p<0.05). Sonuç olarak KE'in insan karaciğer hücre dizisi HepG2 üzerine in vitro şartlarda uygulanmasıyla, bu hücreler üzerinde sitotoksik etki gösterdiği, melatoninin ise antioksidan özelliği ile HepG2 hücre dizilerini bu sitoksisiteden önemli derecede koruduğu sonucuna varılmıştır. Anahtar kelime: Kîorprifos-etil, doku kültürü ve antioksidan enzimler.

42 SUMMARY Clorprifos-etil (KE) is one of the widely used organophosphate insecticides. In this study we have investigated the cytotocsic effect of KE on human liver cell lines, HepG2 and melatonin protective effect of melatonin. The study was conducted in two phases. în the first phase, the effect of KE on viability of HepG2 cell lines and the protective role of melatonin were investigated. In this phase, the groups were organized as follows: 1. The control group (The viability of cell lines of the KE group were evaluated according to this group). 2. The Melatonin group (The viability of cell lines of the Mel+ KE group were evaluated according to this group). 3. The KE group ( Treated with various dozes of KE). 4. The Mel + KE group (In addition to various dozes of KE, melatonin was added.) The cells were planted into 96 well petri cups containing each well 3x1 05 cell. One day lather, the cell in the KE group were incubated for 72 hours at 37° C with KE concentrations of 1080,540, 270, 135, 67.5, 33.7, 16.8, 8.4, 4.2, 2.1, 1 and 0.5 u.g/ml. The HepG2 cells in the Mel +KE group were firstly incubated with 500 ng/ml melatonin and eftarwards were treated with the various KE concentrations like the concentration of KE group for 72 hours. Then, cell viability was determined in the KE and Mel + KE groups. The viability of cells in the KE group was found given significantly low compared to the control group (p<0.05). Cytotocsiticy caused by KE decreaced depending on KE concentration (p<0.05). Additionally, the viability of HepG2 cells, treated with melatonin for one hour and than treated with KE, was found higher than the cells treated with only (p<0.05).43 In the second phase of the study, some experiments were done to clarify the possible mechanism of KE and melatonin. In this phase the groups were organized as follows: 1. The control groups (Only medium was given to the cell) 2. The Mel group (Only melatonin was given to the cell) 3. The KE 67.5 groups (67.5ug/ml KE was given to the cells) 4. The Mel + KE 67.5 group (67.5ug/ml KE was given to the cells) 5. The KE 540 group (540 ug/ml KE was given to tcells) 6. The Mel + KE 540 group (Meatonin and 540ug/ml KE was given to the cells). Melatonin was added at the dose of 500 jig/ml/day for two days after obtaining suitable growth in these cell lines. On the third day, 67.5 and 540 ug/ml KE was given to the relevant groups. The experiment was ended at the fourth day and the level of thiobarbituric acid reactive substances TBARS and the activites of SOD (superoxide dismutase), GSH-Px (glutathione peroxidase) and catalase were determined in the cell homogenates. While administering of KE resulted in significantly decrease in the activities of SOD, GSH-Px and catalase, it caused to increase in the level of TBARS, an indicatorof the end product of lipid peroxidation in the HepG2 cell lines (p<0.005). Melatonin addition before KE administration caused to decrease in TBARS levels and increase in GSH-Px and catalase activities according to the groups treated with onlyKE(p<0.05). As a result; it is congluded that the administration of KE to human liver cell lines HepG2 under in vitro condition showed cytotoxic effects on these cell, and melatonin with its antioxidant property may significantly protect these cell from KE toxicity. Key words: clorpyrifos-etil, tissue culture, antioxidant enzymes