Transfekte hücrelerde oksidatif stresle aktive edilen TRPM2 katyon kanallarının inhibisyonunda selenyumun etkisinin patch-clamp tekniği ile araştırılması

Abstract

Esansiyel bir antioksidan olan selenyum elementinin çeşitli hücre serilerinde hücre içi Ca+2 salınımı üzerine koruyucu etkisinin olduğu son zamanlarda yapılan çalışmalarla gösterilmesine karşın voltaja duyarlı Ca+2 kanalları ve oksidatif stresle (H2O2) aktive olabilen Melastatin-Like Transient Reseptör Potansiyel 2 (TRPM2) kanalları üzerindeki etkileri henüz tam olarak aydınlatılmış değildir. Bu çalışmada, yama-menteşe (patch-clamp) ve fura-2 floresans görüntüleme teknikleri kullanılarak selenyumun Chinese hamster ovary (CHO) hücre serilerinde voltaja duyarlı Ca+2 kanal akımları ve H2O2 ile uyarılmış TRPM2 kanal akımları üzerine etkileri araştırılmıştır.CHO hücrelerine 24-48 saat süre ile DNA transfeksiyonu yapıldı. Floresans ışık altında yeşil ışık yayan hücrelere patch pipeti ile girildi. CHO hücre serisi yama-menteşe ve Ca+2 sinyali analizleri öncesinde 36-48 saat boyunca selenyum ile inkübe edildi. Selenyum patch pipeti vasıtasıyla hücre içerisine de verildi. Selenyum ile inkübe edilen hücrelerde H2O2 ile aktive edilmiş TRPM2 akımlarının tamamen inhibe edildiği gözlemlendi. İntraselüler selenyum, 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) ve N-(p-amylcinnamoyl) anthranilic asit (ACA)'da H2O2 ile aktive edilmiş TRPM2 akımlarını inhibe ettiği gözlemlendi. Selenyum ve selenyum+verapamil+diltiazem inkübasyonunun sitozolik Ca+2 salınımını ve lipit peroksidasyon seviyesini azalttığı görüldü. Glutatyon (GSH) ve glutayon peroksidaz (GSH-Px) seviyelerinin artmasına rağmen 2-APB ile inkübe edilen hücrelerde TRPM2 kanal akımlarının inhibe edilmediği gözlendi.Sonuç olarak; selenyum takviyesinin transfekte CHO hücrelerinde H2O2 nin sebep olduğu Ca+2 akışı ve oksidatif stress artışı üzerine koruyucu etkisini voltaja duyarlı Ca+2 kanalları ve TRPM2 kanalları üzerinden düzenleyici etki göstererek gerçekleştirdiği görülmüştür. Elde ettiğimiz bulgular TRPM2 ve voltaja duyarlı Ca+2 kanallarının aktivasyonuna bağlı nöronal ve hücresel oksidatif toksisitenin selenyum uygulamaları ile azaltılabileceğini göstermiştir.

It has been recently reported protective effects of essential antioxidant element selenium on cytosolic Ca2+ release in a cell lines although the effects of selenium on melastatin-like transient receptor potential 2 (TRPM2) and voltage gated Ca2+ channel actions in response to oxidative stress (H2O2) have not been understood. We investigated the effects of selenium on H2O2-induced TRPM2 and voltage gated Ca2+ channel currents in Chinese hamster ovary (CHO) cell line using patch-clamp and fura-2 fluorescence imaging techniques.DNA transfection has been performed during 24-48 hours. Patch-clamp experiments have been performed by using patch pipettes on green light spreading CHO cells. The CHO cell line was incubated by selenium for 36-48 hours before patch-clamp and Ca2+ signaling analysis. Selenium was also given into the cells by patch pipette. H2O2-induced TRPM2 currents in selenium incubated cells were completely inhibited. Intracellular selenium, 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) and N-(p-amylcinnamoyl) anthranilic acid (ACA) also inhibited the H2O2-induced TRPM2 currents. The cytosolic Ca2+ release and lipid peroxidation levels were decreased by selenium and selenium+verapamil+diltiazem incubations but not 2-APB although glutathione peroxidase activity and reduced glutathione levels increased.In conclusion, selenium supplementation in the transfected CHO cells seems to have protective effects on the H2O2-induced increase of Ca2+ influx and oxidative stress through regulation of TRPM2 and voltage gated Ca2+ channels. The findings may contribute the use of selenium in treatment of TRPM2 and voltage gated Ca2+ channels activation induced-neuronal and cellular oxidative toxicity.