Trombositlerin Candida albicans üzerine antifungal etkinliğinin araştırılması

Abstract

Mantar enfeksiyonlarında etken olarak en sık Candida türleri, özellikle deCandida albicans saptanmaktadır. Bu çalışmada gönüllülerden elde edilentrombositten zengin plazmanın (TZP) C. albicans ATCC 10231 suşuna karşı in vitroantifungal etkinliği ile bu etkinlikte rol oynayabileceği düşünülen bazı kemokin vekinosidinlerin olası etkinliğinin değerlendirilmesi amaçlandı.Dokuz gönüllüden Magellan PRP™ kiti kullanılarak 3'er ml TZP elde edildi.Otolog trombin eldesi için %10'luk kalsiyum glukonat kullanıldı. Otolog trombin ileaktive edilen TZP'nin, son maya konsantrasyonu 1x103 kob/ml ve 1x104 kob/ml olanC. albicans izolatı üzerindeki antifungal etkinliğinin ortaya konulması amacıyla 1.,2., 4., 8. ve 16. saatlerde Sabouraud Dekstroz Agar (SDA) yüzeyine ekimleri yapıldı.30°C'de 18-24 saatlik inkübasyon sonrası koloniler sayıldı. Aynı zamanda her ekimsaatinde kemokin ve kinosidinler [(Trombosit Faktör-4 (Human PF-4), İnterlökin-8(Human IL-8) ve Timosin-β4 (Human TMSB4)] eş zamanlı olarak ELISAyöntemiyle ölçüldü.Trombositten zengin plazmadaki medyan Beyaz Küre (WBC) sayısı;49,4x103/μl, medyan trombosit sayısı 2165x103/μl olarak saptandı. TZP'dekitrombosit ve WBC verimliliğinde yaklaşık 9 kat artış saptandı. Başlangıç mayakonsantrasyonu 103 olan TZP grubunun (TZP-103) saatlere göre üreyen kolonimedyan değerleri sırasıyla 1., 2., 4., 8., ve 16. saatler için 3, 7, 34, 143 ve 500 ikenbaşlangıç maya konsantrasyonu 104 olan TZP grubu (TZP-104) için bu değerler 19,48, 166, 500 ve 500'dü. Aynı saatler için başlangıç maya konsantrasyonu 103 olanPBS (kontrol) grubunun koloni medyan değerleri ise sırasıyla 242, 280, 500, 500 ve500'dü.TZP-103'ün PBS-kontrol grubuyla karşılaştırıldığında antifungal etkinliğinin8. saatte halen devam ettiği, 16. saatte ise kaybolduğu görüldü. İki grup arası 8.saatteki koloni üremelerindeki fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,05). TZP-104'ün antifungal etkinliğinin 4. saatte devam ettiği, 8. saatte bu etkinliğin azaldığı, 16. saatte ise antifungal etkinliğin ortadan kalktığı görüldü. Her iki grupta eşitmiktarda TZP kullanılmış olması ve buna bağlı ortama salınan kemokin ve kinosidinmiktarı aynı olmasına rağmen TZP 103 grubunun daha etkin bulunmasında C.albicans konsantrasyonunun önemli olabileceği düşünüldü.ELISA yöntemiyle her iki TZP'li grupta IL-8 seviyelerinde saatlere göre artışolmakla birlikte C. albicans'a karşı antifungal etki tespit edilmedi. TMSB4 miktarıyoğun trombosit varlığına bağlı olarak PBS-kontrol grubuna göre TZP'li gruplarda7-10 kat daha yüksekti. TZP gruplarında ilerleyen saatlerde TMSB4 değerlerindeantifungal etkinliğine bağlı olarak gerçekleştiği değerlendirilen düşme saptandı. PF-4, TZP-103 ve TZP-104 üzerinde antifungal etkinlikte değildi.Trombositten zengin plazmanın C. albicans ve diğer mantarenfeksiyonlarında etkili olabilmesi için, en yüksek trombosit ve lökosit değerlerininelde edilebileceği tam otomatize kapalı sistemlerin kullanılmasının önemli olduğudüşünülmektedir. En düşük konsantrasyonda en yüksek trombosit değerleri eldeedilen çalışma grubumuzda dahi literatürdeki çalışmalardaki gibi C. albicansüremeleri tamamen yok edilememiştir. Hastalarda kullanılan ilaçlar gibi tekrarlayandozlarda TZP uygulamaları ile antifungal etki daha uzun sürelere erişebilir hattaüremeleri tamamen baskılayacak değerler elde edilebilir. Ayrıca trombositlerinantifungal etkinliğinde rol oynayabileceği düşünülen bütün kemokin, kinosidin vebenzeri diğer molekülleri kapsayan geniş çaplı bir projeye gereksinimduyulmaktadır.Anahtar Kelimeler: Candida albicans, Antifungal Direnci, Trombositten ZenginPlazma.Destekleyen Kurumlar: Çalışmamız Sağlık Bilimleri Üniversitesi BilimselAraştırma Projeleri Biriminden mali destek alınarak yapıldı.

Candida species, especially Candida albicans, are the most commonpathogen detected in fungal infections. In this study, we aimed to evaluate the invitro antifungal activity of volunteer-derived platelet rich plasma (PRP) against C.albicans ATCC 10231 strain and the possible effect of certain chemokines,kinocidins that might play a role in this activity.Three ml of PRP from nine volunteers were derived by using Magellan PRP™ kit. 10% calcium gluconate was used to obtain autologous thrombin. C. albicansisolates with a final yeast concentration of 1x103 cfu/ml and 1x104 cfu/ml wereinoculated on Sabouraud Dextrose Agar (SDA) at the 1st, 2nd, 4th, 8th and 16th hoursof incubation in order to reveal the antifungal activity of autologous thrombinactivatedPRP. The colonies were counted after 18-24 hours of incubation at 30°C.At the same time, chemokines and kinocidins [(Platelet Factor-4 (Human PF-4),Interleukin-8 (Human IL-8) and Thymosin-β4 (Human TMSB4)] were measuredsimultaneously by ELISA method.The median values of white blood cells (WBC) and platelets in PRP weredetected as 49,4x103/μl and 2165x103/μl, respectively. Approximately 9-foldincrease in platelet and WBC efficacy in PRP was detected. The colony medianvalues of the PRP groups with an initial yeast concentration of 103 and 104 (PRP-103and PRP-104) were found to be 3, 7, 34, 143, 500 and 19, 48, 166, 500, 500 for 1st,2nd, 4th, 8th and 16th hours, respectively. The colony median values of the PBS-(control) group with an initial yeast concentration of 103 for the same hours were242, 280, 500, 500 and 500, respectively.Compared with the PBS-control group, the PRP-103 showed that theantifungal activity was still going on at the 8th hour and disappeared at the 16th hour.The difference in colony production between the two groups at 8th hour wasstatistically significant (p<0,05). It was observed that the antifungal activitycontinued at the 4th hour, decreased at the 8th hour, and disappeared at the 16th hour in the group PRP-104. Although the same amount of PRP was used and the sameamount of chemokine and kinocidins were released in both groups, the concentrationof C. albicans was considered to be important in the detection of more effectivePRP-103 group.Although there was an increase in IL-8 levels by hours in the two PRP groupsby ELISA method, no antifungal effect was detected against C. albicans. Test resultsof TMSB4 were detected 7-10 times higher in the PRP groups than in the PBScontrolgroup due to the presence of intense platelet concentration. It was observedthat decrease in TMSB4 values results from the antifungal activity on the advancinghours in the PRP groups. Whereas PF-4 did not act an antifungal activity on PRP-103and PRP-104.It was considered that the use of fully automated systems to obtain highestplatelet and leukocyte counts in PRP is important in order to be effective in C.albicans and other fungal infections. Even in our study group where the highestplatelet counts were obtained at the lowest concentration, C. albicans reproductioncould not completely eliminated as mentioned in the literature. Repeated doses ofPRP applications, such as drugs used in patients, may have longer duration of actionand even complete repression of reproductive outcomes. In addition, a large-scaleproject involving all chemokines, kinocidins, and other molecules thought to play arole in the antifungal activity of platelets is needed.Keywords: Candida albicans, Antifungal resistance, Platelet Rich Plasma.Supporting Institutions: This study is supported by University of Health Sciences,Scientific Research Projects Unit.