3D endometrium benzeri kültür sistemi kullanılarak in vitro implantasyon modelinin geliştirilmesi

Abstract

Amaç: Hem embriyo hem de kanser hücrelerinin invazyon modelinde kullanılabilecek üç boyutlu (3D) endometrium benzeri kültür sisteminin geliştirilmesi ve bu sisteme invaziv özellikte olan hücrenin ekimi ile epitelyal mezenkimal geçiş mekanizmasının araştırılması amaçlanmıştır. İn Vitro üç boyutlu endometrium benzeri kültür sistemi, poröz bakteriyel selüloz (BC), kollajen köpük (COL/K) ve kollajen fiber (COL/F) doku iskeleleri üzerine endometrium epitelyal hücre hattı (RL95-2) ile invaziv sferoid oluşturma özelliği olan trofoblast benzeri koriyokarsinom (JAR) hücre hatlarının tekli ve ikili ekimi sonucunda implantasyon, invazyon basamaklarında görülen epitelyal mezenkimal geçiş mekanizmasının araştırılması hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Çalışmada üretilen üç farklı tip doku iskelesi ile ticari olarak satın alınan RL95-2 ve JAR hücreleri kullanılmıştır. Hücreler uygun besiyerlerinde kültüre edilip, %80 konfluent olduktan sonra doku iskeleleri üzerine tekli veya ikili olarak ekilmiştir. Kültürün 3., 5., 7., 10. ve 14. günlerinde iskeleler %4 paraformaldehit ile fikse edilerek frozen kesitleri alınmıştır. Epitelyal belirteç olarak E-kaderin, mezenkimal belirteç olarak N-kaderin, Vimentin, α-SMA ve Syndecan-1 dağılımları indirekt immunoperoksidaz ya da immunofloresan boyama yöntemleri ile analiz edilmiştir. Doku iskelelerinin karakterizasyonu ise SEM yöntemi ile yapılmıştır.Bulgular: RL95-2 hücrelerinde E-kaderin, N-kaderin, Vimentin, α-SMA ve Syndecan-1 immunoreaktivitelerinin JAR hücrelerinden daha fazla olduğu, E-kaderin ve Syndecan-1 dağılımlarının RL95-2 hücresinde, N-kaderin ve Syndecan-1 immunoreaktivitelerinin de JAR hücrelerinde diğer belirteçlere oranla daha fazla olduğu görüldü. Doku iskelelerinin karakterizasyonu sonucunda; BC gözenek büyüklüğü 97 ± 28 µm, COL/K gözenek büyüklüğü 109 ± 21µm ve COL/F doku iskelelerinin çapının ise 0,67 ± 0,14 µm olduğu saptandı. Epitelyal mezenkimal geçiş belirteçlerinin her üç doku iskelesinde de boyandığı, fakat BC' un özellikle metastatik kurulacak modellerde JAR hücrelerinin kullanılmasında, COL/K doku iskelesinde JAR hücrelerinin 7. günde, RL95-2 hücrelerinin ise 14. günde mezenkimal özelliklerinin daha fazla olduğu, COL/F doku iskelesi kültüründe ise, RL95-2 hücrelerinin erken dönem kültürlerinde epitelyal özellikten mezenkimal özelliğe dönmesini desteklediği, RL95-2 ve JAR hücrelerinde E-kaderin, N-kaderin, Vimentin, α-SMA ve Syndecan-1' in kültürün 14. gününde daha fazla olduğu gözlendi. Sonuç ve Yorum: Farklı iskeleler kullanılarak geliştirilen 3D endometrium benzeri kültür sistemi ile hem kanser hücrelerinin invazyonu sırasında hem de embriyo implantasyonu sırasında görülen epitelyal mezenkimal geçiş mekanizmasının farklı günlerdeki ifadelerinde değişim saptandığı ve kurulan bu modellerin ileriki araştırmalar için bir ön çalışma niteliğinde olduğu düşünülmüştür.

Aim: For using both embryo and invasion models, we aimed to investigate three dimensional (3D) endometrium-like culture system invasive culture and epithelial mesenchymal transition mechanism. Via in vitro three-dimensional endometrium-like culture system, epithelial mesenchymal transition in both implantation and invasion process were analyzed using single or combine culture of endometrium epithelial (RL95-2) and trophoblast-like chiocarcinoma (JAR) cell lines on bacterial cellulose (BC), collagen foam (COL/K) and collagen fiber (COL/F) porous scaffolds. Materials and Methods: Three different types of tissue scaffolds were used in the study and RL95-2 and JAR cells were purchased commercially. Cells were cultured on appropriate media, after 80% confluency of the cells, they were plated onto scaffolds separately or combine. On culture time; 3., 5., 7., 10. and 14. days, the scaffolds were fixed with 4% paraformaldehyde and frozen sections were taken. Distributions of E-cadherin as an epithelial marker, N-cadherin, Vimentin, α-SMA and Syndecan-1 as a mesenchymal marker were analyzed by indirect immunoperoxidase or immunofluorescence staining methods. Characterization of scaffolds were analyzed by SEM method.Results: In the RL95-2 cells, immunoreactivities of E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, α-SMA and Syndecan-1 were higher than JAR cells, in addition, E-cadherin and Syndecan-1 immunoreactivities in RL95-2 cells, N-cadherin and Syndecan-1 immunoreactivities in JAR cells were significantly higher. After the characterization of the scaffolds BC pore size of 97±28 μm, a COL/K pore size of 109±21 μm and a COL/F tissue scaffold of 0, 67 ± 0,14 µm in diameter were detected. The epithelial mesenchymal transition markers were stained in all three scaffolds, however, for epitelial mesenchymal transition BC and JAR cells, the mesenchymal properties of JAR cells on day 7, RL95-2 cells on day 14 on COL/K tissue scaffold were higher, whereas COL/F scaffold was supported epithelial properties of RL95-2 cells, in addition, immunoreactivities of E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, α-SMA and Syndecan-1 were higher on combine culture of RL95-2 + JAR cells on this scaffold at 14. Day of the culture time. Conclusion: The newly developed 3D endometrium-like culture system using different scaffolds was supported the epithelial mesenchymal transition mechanisms in both cancer cell invasion and embryo implantation during different culture periods and it can be a preliminary study for further research.