Preparation of cellulase gene probes for thermophilic fungi by PCR

Abstract

oz PCR YÖNTEMİ İLE TERMOFİLİK MANTAR TÜRLERİ İÇİN SELÜLAZ GEN SONDALARININ HAZIRLANMASI ÖZTÜRK, Zahide Neslihan Yüksek Lisans, Gıda Mühendisliği Bölümü Tez Danışmanı: Doç. Dr. Zümrüt B. ÖGEL Yardımcı Tez Danışmanı: Dr. Mehmet BATUM Haziran 1999, 103 sayfa Bu tezin amacı termofılik mantar türleri için PCR yöntemi ile selülaz gen sondalarının hazırlanmasıdır. Bu amaçla, PCR yöntemi ile, termofilik mantar türlerinin selülaz, asıl olarak endoglukanaz genlerim sayıca çoğaltabilecek dejenere primerler dizayn edilmiştir. Dejenere primerlerin dizaynı, mantarların selüloza bağlanan bölgelerinde bulunan iyi korunmuş bölge temel alınarak yapılmıştır. Dizayn sırasında, primerlerin dejeneresini azaltmak için Trichoderma reesei, Humicola insolens ve Trichoderma longibrachiatum endoglukanaz dizilimlerine özel önem verilmiştir. Dizayn edilen dejenere primerler Torula thermophila ve H. insolens'va. hücre DNA'sının, PCR yöntemi ile sayıca çoğaltılmasında kullanılmıştır. T. thermophila hücre DNA'sı uzunlukları 300 ve 100 baz çifti olan iki parça, H. insolens hücre DNA'sı ise uzunluğu 100 baz çifti olan tek parça vermiştir. Bu parçaların özgüllüğü T. reeseVmn, PCR ileçoğaltılmasıyla elde edilmiş radyoaktivite ile işaretlenmiş, 1584 baz çiftlik egB geni kullanılarak heterolog hibridleşme yöntemi ile analiz edilmiştir. Sonuç olarak, T. reeseV nin egl3 geni ile gözlenen benzeşmeye bağlı olarak, dejenere primerlerin hem H. insolens>'m hem de T. thermophild'mn selülaz genleri içindeki bir bölgeyi sayıca çoğaltılmış olmasının kuvvetle muhtemel olduğu belirlenmiştir. Buna bağlı olarak, hem T. thermophild' n/n hem de H. insolens' in hücre DNA'sından dejenere primerler yardımı ile sayıca çoğaltılan gen parçalan termofılik mantarların selülaz genlerinin klonlanmasında kullanılabilecektir. Anahtar kelimeler; Selülaz, Selülaz sondası, PCR, T. thermophila, H. insolens, T. reesei. vı

ABSTRACT PREPARATION OF CELLULASE GENE PROBES FOR THERMOPHILIC FUNGI BY PCR ÖZTÜRK, Zahide Neslihan M.S., Department of Food Engineering Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Zümrüt B. ÖGEL Co-Supervisor: Dr. Mehmet BATUM June 1999, 103 pages The aim of this thesis was the preparation of cellulase gene probes for thermophilic fungi by PCR. In this respect, degenerate primers were designed which can amplify cellulase, mainly endoglucanase genes of thermophilic fungi by PCR. The design of the degenerate primers was based on the well-conserved re gion found in the cellulose binding domains of fungi. In the design, the endoglu canase sequences of Trichoderma reesei, Humicola insolens and Trichoderma longibrachiatum were given special emphasis to decrease the degeneracy of prim ers. Degenerate primers designed were used in the amplification ofTorula thermo- phila and H. insolens genomic DNA by PCR. T. thermophila genomic DNA re sulted two fragments of lengths 300 and 100 base pairs and H. insolens genomic DNA gave a single band of length 100 base pairs. The specificity of these frag ments were analyzed by heterologous hybridization using radioactively labeled, iiiPCR-amplifıed, 1584 base pairs egB gene of T. reesei. The results strongly sug gest that the degenerate primers have amplified a region within the cellulase genes of T. thermophila as well as H. insolens due to the established homology with the egB gene of T. reesei. Accordingly, the genomic fragments amplified by the de generate primers, from both T. thermophila and H. insolens DNA, can be used as cellulase gene probes for cloning cellulase genes of thermophilic fungi. Key words; Cellulase, Cellulase probe, PCR, T. thermophila, H. insolens, T. reesei. IV