Evaluation of kallistatin and some biochemical parameters in rat with experimental liver injury

Abstract

Kallistatin karaciğerde lipopolisakkarid kaynaklıinflamasyon sonrası ekspresyonu azaltan negatif akut faz protein olarak görev yapmaktadır. BuçalıĢmada, farklı derecelerde karaciğer yetmezliği oluĢturulan ratlarda kallistatin düzeyleri ilekaraciğerdeki hasarın dereceleri arasında iliĢkinin olup olmadığının ortaya konulması amaçlandı. Hayvanmateryali olarak; Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Deney Hayvanları Üretim ve AraĢtırma Merkezi'ndentemin edilen ve canlı ağırlıkları 200-400 gr arasında değiĢen 32 adet Wister Albino erkek rat kullanıldı.ÇalıĢmaya alınan 32 rat her grupta 8 rat olmak üzere kontrol (grup1, n=8 ), grup 2 (hafif, n=8), grup 3(orta, n=8) ve grup 4 (Ģiddetli, n=8) olarak sınıflandırıldı. Ratlarda deneysel karaciğer hasarı oluĢturmakiçin parafin yağında çözündürülen değiĢik yüzdelik oranlarında karbon tetraklorür (CCl4) solüsyonlarısubkutan uygulandı. Grup 1: Sağlıklı ratlara normal beslenme programı dıĢında herhangi bir Ģeyuygulanmadı ve bu gruptaki ratlar kontrol (n=8 erkek sıçan ) grubu olarak adlandırıldı. Grup 2: Bugruptaki ratlara (n=8 erkek sıçan), % 25 CCI4 (parafin likitte çözdürülmüĢ) solüsyonu her ratta 2 ml/kgdozda, subkutan olarak haftada iki kez ve 4 hafta boyunca uygulandı. Bu gruptaki ratlar hafif derecedekaraciğer bozukluğunu Ģekillendiği için hafif grup olarak adlandırıldı. Grup 3: Bu gruptaki ratlara ilk dörthafta % 25 CCI4 (parafin likitte çözdürülmüĢ) solüsyonu her ratta 2 ml/kg dozda subkutan olarak haftadaiki kez ve 4 hafta boyunca uygulandı ve kalan 2 hafta % 50 CCl4 (parafin likitte çözdürülmüĢ) solüsyonu2 ml / kg subkutan olarak 2 hafta boyunca uygulandı (toplamda 6 hafta boyunca) ve gruptaki ratlar ortagrup (n=8 erkek sıçan) olarak adlandırıldı. Grup 4: bu grup için aynı grup 3 prosedürü uygulanmıĢ vedaha sonra 2 hafta boyunca parafin yağı tedavisinde 2 ml / kg % 62.5 CCl4 subkütan yoldan enjekteedildi (toplamda 8 hafta boyunca) ve bu gruptaki ratlar Ģiddetli grup (n=8 erkek sıçan) olarak adlandırıldı.ÇalıĢmanın 4. haftasında grup 2'deki, 6. haftasında grup 3'deki ve 8. Haftasında grup 4'deki ve kontrolgrubundaki ratlara ksilazin 60 mg/kg ve Ketamin 7.5 mg/kg kombinasyonları kas içi uygulandı ve buuygulamalardan 20-30 dakika sonra ratlar sakrifiye edildi. Sakrifiye edilen ratların kalbinde hemenhematolojik ve biyokimyasal analizler için antikogulantlı ve antikogulantsız tüplere kan numunelerialındı. Hematolojik parametrelerin analizi aynı günde antikoagulantlı tüplere alınan kan örneklerinden,hematokrit değer, hemoglobin konsantrasyonu, lökosit sayısı, trombosit sayısı ve MCHC değerleri Ġçhastalıkları Anabilim dalımız laboratuvarında bulunan Veteriner Hemogram cihazı (Veterinary MS4-s-Melet Schloesing Laboratories in France) ile ölçüldü. Biyokimyasal parametrelerin ölçümü içinantikuagulantsız tüplere alınan kan örnekleri 3000 devir/dk 15 dakika santrifüje edilerek serumlarıçıkarıldı. Elde edilen serumlar ölçümler yapılıncaya kadar -20 °C'de muhafaza edildi. Serum AST, ALT,LDH ve GGT düzeylerinin ölçümü için elde edilen serumlarda ticari kitler kullanılarak otoanalizatör (BS-120 Vet-Mindray) cihazıyla ölçümleri yapıldı. Serum Rat Kallistatin (Katalog NO: YLA1624RASERĠNA4, ELISA kit Ylbiont), Rat kollajen tip I (Col I, Katalog NO:YLA0195RA, ELISA kiti Ylbiont)ve Rat kollajen tip III (Col III, Katalog NO: YLA0605RA ELISA kit Ylbiont) seviyeleri ticari ELISA testkitleri kullanılarak ve test kitlerinin prosedüründe belirtildiği Ģekilde ELISA cihazıyla ölçümleri yapıldı.Hematolojik parametrelerin istatistiksel analizinde, karaciğer hasar gruplarına ait sıçanların WBC, Neu,LYM, Mon, PCT düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek (p<0.05) tespit edilirken, MCHve MCHC düzeyleri ise daha düĢük saptandı (p.<0.05). Ancak RBC, Hct ve MPV değerleri matematikselolarak yüksek ve MCV ve Hb değerleri matematiksel olarak düĢük olmasına rağmen istatistiksel olarakanlamlı bulunmadı (p<0.05). Biyokimyasal parametrelerin istatistiksel analizinde, serum ALTdüzeylerinin analizinde; ġiddetli karaciğer hasarı olan sıçanların serum ALT düzeylerinin hafif ve ortaderecede karaciğer hasarı olanlardan anlamlı derecede yüksek olduğu bulundu. Hafif ve orta Ģiddettekaraciğer hasar gruplarının ALT düzeyleri kontrol grubunun ALT düzeyleri ile karĢılaĢtırıldı ve anlamlıbir fark bulunmadı. Serum AST düzeylerinin analizinde; Ģiddetli derecede karaciğeri hasarı oluĢturulanratların serum AST düzeyleri kontrol, hafif derecede ve orta derecede karaciğeri hasarı oluĢturulanratların AST düzeylerine göre anlamlı düzeyde yüksek bulunurken hafif derecede karaciğeri hasarıoluĢturulan ratların AST düzeyleri ile kontrol grubunu AST düzeyleri arasındaki fark anlamlı bulunmadı.Serum GGT düzeylerinin analizinde; ġiddetli karaciğer hasarı olan sıçanların serum GGT düzeylerinin,hafif ve orta derecede karaciğer hasarı sıçanlarının GGT düzeylerinden anlamlı derecede yüksek olduğu,karaciğer hasarı grupları (hafif ve orta) ile kontrol grubu arasında anlamlı bir fark olmadığı bulundu.Serum LDH düzeylerinin analizinde; ġiddetli karaciğer hasarı olan sıçanların serum LDH seviyeleri; hafifila orta Ģiddette karaciğer hasarı ve kontrol grubu olan sıçanların LDH düzeylerinden anlamlı derecedeyüksek tespit edildi. Ayrıca hafif ve orta Ģiddette karaciğer hasarı grupları arasında anlamlı fark73bulunmadı. Serum kollajen-I düzeylerinin analizinde; Karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların serumkollajen-I düzeyleri kontrol grubunun kollajen-I göre önemli düzeyde yüksek tespit edildi. Benzer ĢekildeKaraciğeri hasarı oluĢturulan ratların serum kollajen-III düzeyleri kontrol grubunun kollajen-III göreönemli düzeyde yüksek tespit edildi. Kallistatin düzeylerinin analizinde; serum kallistatin düzeylerikaraciğer hasarı oluĢturulan tüm gruplarda kontrol grubuna göre düĢük bulundu. Gruplar arasıkarĢılaĢtırmada ise Ģiddetli derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların kallistatin düzeylerinin hafifderecede karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların kallistatin düzeylerine göre anlamlı düzeyde düĢük tespitedildi. Orta derecede karaciğeri hasarı oluĢturulan kallistatin düzeyleri hafif derecede karaciğeri hasarıoluĢturulan ratların kallistatin düzeyleri ile arasında fark bulunmadı. Kontrol grubu ratların ile Karaciğerhasarı oluĢturulan ratlarının karaciğer organın histopatolojik incelenmesinde kontrol grubunun ratlarınkaraciğer dokusunun histolojik görünümü normal görünümde olduğu saptanırken, karbontetra klorürlekaraciğer hasarı oluĢturulan ratların karaciğer dokusunda Ģiddetli derecede morfolojik değiĢikliklersaptandı. Karaciğer organın özellikle vena centralis ve orta-zon bölgelerinde hepatositlerde hidropikdejenerasyon ve pıhtılaĢma nekrozu tespit edildi. Bazı vena centralis (Periacinary fibrosis) ve portalalanlarda fibroz yapı mevcut, ince kollajen demetlerinin portal izlerinden parankime yayılması veaktivasyon, perisinusoidal miyofibroblastik hücrelerde de gözlendi. Karaciğer portal izlerinde vekaraciğer parankimi içinde birkaç makrofaj ile karıĢmıĢ lenfoid hücrelerin zaman zaman biriktiğigözlendi. Bu değiĢiklikler, hücrelerin ayrıĢması ve ağır CCl4 tedavi grubu sıçanlarının karaciğerparankiminde karaciğer lob mimarisinin bozulması ile sonuçlanmıĢtır. Karbontetra klorür ile değiĢikderecelerde karaciğer hasarı oluĢturulan ratların hematolojik, biyokimyasal parametreler ve karaciğerdokusunun histopatolojik incelenmesi kontrol grubuna göre değerlendiriliğinde önemli düzeydedeğiĢiklikler saptandı. Karbontetra klorürle karaciğer hasarı oluĢturulan (karaciğer hasarı gruplarında)ratların karaciğer dokusundaki hasarın Ģiddeti derecede morfolojik değiĢiklikler ile kallistatin düzeyleriarasında bir iliĢkinin olduğu hem biyokimyasal hemde hematolojik parametrelerle ortaya konuldu. Sonuçolarak; Karaciğeri hasarı oluĢturulan ratların kallistatin düzeylerindeki değiĢimleri ile karaciğerdokusunda oluĢan hasara paralel olarak önemli düzeyde düĢük tespit edildi. Serum kallistatindüzeylerindeki değiĢimlerin karaciğer doku hasar düzeylerinin belirlenmesinde ve karaciğerhastalıklarının tedavisinde uygulanan tedavi prognozunun değerlendirilmesinde önemli bir parametreolduğu sonucuna varılmıĢtır.Anahtar Kelimeler: Kallistatin, Karaciğer hasarı, CCl4, Biyokimyasal parametrelerin

Kallistatin acts as a negative acute phase proteinthat reduces expression after lipopolysaccharide-induced inflammation in the liver. In this study, it wasaimed to determine whether there is a relationship between the levels of Kallistatin and liver damage in ratswith different degrees of liver failure. The material of this study consisted of 32 Wister Albino male ratsobtained from Van Yüzüncü Yıl University Experimental Animals Production and Research Center andweighing between 200-400 gr were used. Thirty-two rats were included in 8 rats in each group as to group 1(control, n=8), group 2 (mild, n=8), group 3 (moderate, n = 8), group 4 (severe, n=8). In order to causeexperimental liver damage in rats, carbon tetrachloride (CCl4) solutions of different percentages dissolvedin paraffin oil were applied subcutaneously. Group 1: Healthy rats will not be treated with anything otherthan the normal diet. Rats in this group were named as control (n=8 male rats). Group 2: In this group(n=8 male rats), 25% CCI4 (dissolved in paraffin liquid) solution was applied to each rat at a dose of 2 ml/ kg twice a week subcutaneously for 4 weeks. The rats in this group were named as mild group becauseof mild liver impairment. Group 3: 25% CCI4 (dissolved in paraffin liquid) solution was administered to ratsin this group for 4 weeks in 2 ml / kg subcutaneously twice a week (as same as group 2) and theremaining 2 weeks were treated with 2 ml/kg of 50% CCl4 (dissolved in paraffin liquid) solution (for atotal of 6 weeks) and the rats in the group were named as the middle group (n=8 male rats) (Table 6).Group 4: the same procedure of group 3 had been applied for this group then proceed with injectedsubcutaneously of 2 ml/kg of 62.5% CCl4 in paraffin oil treatment for the 2 weeks (on the whole 8 weeks)and this group was named as the severe group (n=8 male rats). Xylazine 60 mg / kg and Ketamine 7.5 mg/ kg combinations were administered intramuscularly to rats in group 2 at the 4th week of the study,group 3 at in the sixth week of study, group 4 in the eighth week of the study and control group rats and20-30 minutes from these applications. Then the rats were sacrificed. Blood samples were taken intoanticogulant and non-anticogulant tubes for immediate hematological and biochemical analyzes in theheart of sacrified rats. Hematological parameters, hemoglobin concentration, leukocyte count, plateletcount and MCHC values were measured on the same day with the Veterinary Hemogram Device(Veterinary MS4-s-Melet Schloesing Laboratories in France). Blood samples were taken intoantiquagulant-free tubes for centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes. The sera obtained were stored at -20 ° C until measurements were made. Serum AST, ALT, LDH and GGT levels were measured byautoanalyser (BS-120 Vet-Mindray) using commercial kits. Serum Rat Kallistatin (Rat Kallistan, CatalogNO: YLA1624RA SERINA4, ELISA kit Ylbiont), Rat collagen typeⅠ(Col I, Catalog NO: YLA0195RA,ELISA kit Ylbiont) and Rat collagen type III (Col III , Catalog NO: YLA0605RA ELISA kit Ylbiont )levels were measured using commercial ELISA test kits and with the ELISA instrument as specified inthe procedure of the test kits. In the statistical analysis of hematological parameters, WBC, Neu, LYM,Mon, PCT levels in liver damage groups were significantly higher than the control group (p<0.05), whileMCH and MCHC levels were lower (p<0.05). Although, RBC, Hct and MPV values were found to bemathematically high, and MCV and Hb values were mathematically low, they were not statistically significant(p<0.05). In the statistical analysis of biochemical parameters, in the analysis of serum ALT levels; serumALT levels of rats with severe liver injury were found to be significantly higher than those of mild andmoderate liver injury, whereas ALT levels of mild and moderate liver injury were compared with ALTlevels of control group and no significant difference was found. In the analysis of serum AST levels;serum AST levels of rats with severe liver injury were significantly higher than those of rats with mildand moderate liver injury, but there was no significant difference between AST levels of mild liver injuryand AST levels of control group. In the analysis of serum GGT levels; Serum GGT levels of rats withsevere liver injury were found to be significantly higher than the GGT levels of mild and moderate liverinjury rats, whereas there was no significant difference between liver injury groups (mild and moderate)and control group. In the analysis of serum LDH levels; serum LDH levels of rats with severe liverinjury; was significantly higher than the LDH levels of rats with mild to moderate liver injury and controlgroup, and also there were no significant difference between mild and moderate in rats belonging to liverinjury groups. In the analysis of serum Collagen-I levels; Serum Collagen-I levels of rats with liver injurywere significantly higher than those of the control group. Similarly, serum Collagen-III levels of rats withliver injury were significantly higher than those of the control group. The comparison between the groupswas statistically exposed a significant difference between the kallistatin levels of mild liver injury and thekallistatin levels of severe liver injury, however there was no difference was found between the kal levels71of moderate and severe liver injury groups. Histopathological examination of the liver organ of the liverand control group rats revealed that the liver tissue had normal histological appearance, while the livertissue of carbontetra chloride (in rats belonging to liver injury groups) showed severe morphologicalchanges. These findings were hydropic degeneration and coagulation necrosis was detected in hepatocytes,especially in the vena centralis and mid-zone regions. Fibrosis was present in some vena centralis (Periacinaryfibrosis) and portal areas. The spread of thin collagen bundles from the portal marks to the parenchymawas observed only. Activation was also observed in pericinusoidal myofibroblastic cells. Lymphoid cellsmixed with several macrophages were observed to accumulate occasionally in portal scars and liverparenchyma. These changes resulted in cell dissociation and disruption of the liver lobe architecture in the liverparenchyma of heavy CCl4 treatment group rats. When the histopathological examination of the hematological,biochemical parameters and liver tissue of rats with different degrees of liver damage were made with carbontetrachloride, significant changes were found in the control group. The relationship between the severity of livertissue damage and the Kallistatin levels of the liver tissue of rats with carbontetra chloride (liver injurygroups) was demonstrated by both biochemical and hematological parameters. As a result; Changes in theKallistatin levels of rats with liver injury were found to be significantly low in parallel with the damage tothe liver tissue. It was concluded that changes in serum kallistatin levels are an important parameter indetermining liver tissue damage levels and evaluating treatment prognosis in the treatment of liverdiseases.Key Words: Kallistatin, Liver injury, CCl4, Biochemical parameters