Solunumsal patojen virusların IFAT ve multiplex PCR yöntemleri ile tanısı

Abstract

XIIÖZETAntiviral tedavinin planlanmasâº, hastane içi yayâºlâºm⺠önlemek, enfeksiyontakibi ve gözetimini sağlamak, hastane giderlerini ve hastanın hastanede kalış süresiniazaltmak gibi sebeplerden dolay⺠respiratuvar viruslerin taranmas⺠ve tanâºsâºnâºnkonmas⺠oldukça önemlidir. Solunum yolu enfeksiyonu semptomlar⺠gösterençocuklarda, floresan antikor tekniği veya kültürle izolasyon gibi standart laboratuvarmetotlar⺠ile viruslar % 13- % 45 oranlar⺠arasâºnda tespit edilebilmektedir. Buçalışmada, akut solunumsal hastalık semptomları gösteren çocuklardan alınannazofarengial sürüntü ve kan örneklerinde iki farkl⺠yöntemle solunumsal viruslar veonlara karşı gelişen IgM antikorlarının araştırması ile klinik tanının desteklenmesiamaçlanmıştır.Yeni geliştirilmiş ve kullanıma girmiş olan Multipleks kantitatif ReversTranskriptaz (RT) PCR Enzim Hibridizasyon Assay (Hexaplex Plus; Prodesse, USA)yöntemi ile nazofarengeal örneklerden tek tüpte Respiratuvar Sinsityal Virus (RSV),İnfluenza Virus Tip A (FluA), İnfluenza Virus Tip B (FluB), Parainfluenza Virus Tip1, 2 ve 3 (PIV1, PIV2 ve PIV3) ve Human Metapneumo Virus (hMPV) araştırılmıştır.Bu test yedi farklı solunumsal virusun araştırılması ve kantitasyonunda her virus içinkorunmuş bölgelerden hazırlanmış altı ve yarım primerler karıştırılarakhazırlanmıştır. Floresan antikor tekniği (FAT-Euroimmun GmbH, Almanya) ile deRSV, FluA H1N1, FluA H3N2, FluB, PIV1, PIV2, PIV3 ve Adenovirus (AdV)'ekarşı kanda oluşmuş IgM antikorları araştırılmıştır.Çalışma, bir yıllık dönemde, 46 hastadan alınan kan örnekleri venazofarengial sürüntü örnekleri ile gerçekleştirilmiştir. Örnek toplanan hastalarınyaşları 1 ay- 13 yaş arasındadır (ortalama 16.4 ± 4.5 ay). Örneklerin % 52'si erkek, %48'i bayan hastalardan oluşmaktadır.Alınan 46 kan örneğinden 13 tanesi (% 28.3) FAT ile (MPV hariç), aynısayıda nazofarengial sürüntü örneğinden 8 tanesi (% 17.4) multiplex PCR yöntemi ile(AdV hariç) bir veya daha fazla sayâºda respiratuvar virus açâºsâºndan pozitif olaraksaptanmıştır (P<0.001). Pozitif bulunan sonuçlar; multiplex PCR ile 8 FluA, 1 FluB,5 hMPV, 3 PIV3 ve 1 RSV; FAT yöntemi ile 9 FluA H1N1, 8 FluA H3N2, 8 FluB, 3PIV3 ve 2 RSV olarak saptanmıştır. Bulunan sonuçlar multiplex PCR ve FATkarşılaştırılması açısından değerlendirildiğinde; Multiplex PCR ve/veya FAT'dapozitif bulunan sonuçlarâºn sadece PCR'da pozitif bulunan sonuçlara oranâº; RSV içinXIII1/2 (% 50), FluA için 8/9 (% 88.9), FluB için 1/8 (% 12.5) ve PIV3 için 3/3 (% 100)olarak belirlenmiştir.Sonuç olarak; Multiplex PCR ve FAT yöntemlerinin, çocuklarda respiratuvarviral patojenlerden kaynaklanan solunum yolu hastalâºklarâºnâºn hâºzl⺠laboratuartanâºsâºnda tercih edilebilir olacağı kanısına varılmıştır.Anahtar sözcükler: Solunumsal viruslar, IFAT, Multiplex PCR

XIVSUMMARYAccurate detection of respiratory viruses is important to guide antiviraltherapy, prevent nosocomial spread, provide surveillance and in some cases, decreasehospital costs and lengths of stay. By using standard laboratory methods, such asstaining with fluorescent antibodies (FAT) and isolation by culture, viruses have beendetected in 13 to 45 % of children with symptoms of respiratory illness. In this study;two diagnostic methods used for respiratory viruses have shown acute respiratorytract infection symptoms in childrens.Detection of IgM antibodies from blood by fluorescent-antibody (FAT-Euroimmun GmbH Germany) and Multiplex RT PCR assays (Hexaplex Plus,Prodesse Inc. USA) for detection of respiratory syncytial virus (RSV), influenza virustype A (FluA), influenza virus type B (FluB), parainfluenza virus types 1, 2, and 3(PIV1, PIV2, and PIV3), human metapneumovirus (MPV) and adenovirus (AdV)from nasopharyngeal samples. A multiplex quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction-enzyme hybridization assay (RT-PCR) was developed andused to rapidly detect and quantitative RNA of seven viruses in nasopharyngealspecimens in a single test. Primers and probes originated from highly conservedregions of each viral genome. Six and a half primer pairs were mixed for thesimultaneous detection and quantitation of RNA from seven different respiratoryviruses. This was carried out in 46 nasopharyngeal and bloods specimens fromchildren with respiratory illnesses collected over a 1-year period.The median age of the patients from whom the specimens were collected was16.4 ± 4.5 months (range 2 months to 13 years); Fifty-two percent of samples werefrom male patients, and 48 % were from female patients. Of these 46 bloodspecimens, 13 (28.3 %) were positive by FAT (2 for RSV, 9 for FluA-H1N1, H3N2,8 for FluB, 3 for PIV3). Of these 46 nasopharyngeal specimens, 8 (17.4 %) werepositive by Multiplex PCR (1 for RSV, 8 for FluA, 1 for FluB, 3 for PIV3, 5 forMPV, and 1 for both FluA and 5 for hMPV, AdV absent in Hexaplex Plus). Thenumber of specimens positive only by PCR among specimens positive by PCR and/orFAT was 1 (50.0 %) of 2 for RSV, 8 (88.9 %) of 9 for FluA, 3 (100 %) of 3 for PIV3(P < 0.001).Use of both Multiplex PCR and FAT to identify viral respiratory pathogens inchildren will lead to improved diagnosis of respiratory illness.Key Words: Respiratory viruses, IFAT, Multiplex PCR