İneklerde spontan ovidukt kasılımları üzerine nitrik oksitin etkisinin in vitro olarak belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmada, östrüs siklusunun farklı evrelerindeki ineklerde, ovidukt'un spontan kasılımları üzerine nitrik oksit (NO)' in etkisinin in vitro olarak belirlenmesi ve nitrik oksit sentaz (NOS) enzimlerinin ekspresyon modellerinin ortaya konulması amaçlandı.Özel mezbahalardan elde edilen 64 Holstein ineğin 88 oviduktu değerlendirildi. Hayvanlar seksüel sikluslarına göre metöstrüs, erken diöstrüs, geç diöstrüs ve folliküler evre olmak üzere 4 gruba ayrılarak progesteron (P4) ve NO düzeylerinin belirlenmesi için kanları alındı. İzole organ banyosu çalışmaları için 40 ineğe ait luteal yapı bulunan ovaryum tarafındaki oviduktun istmus ve ampulla kısımlarından longitidunal ve sirküler düz kas şeritleri hazırlandı. Dokularda endojen NO etkinliğini belirlemek amacıyla L-arjinin, Nitro-L-arjinin-metil-ester (L-NAME) + L-arjinin ve metilen mavisi (MB) + L-arjinin uygulanırken, eksojen NO etkinliğini belirlemek için sodyum nitro prusid (SNP) verildi. İmmünohistokimyasal boyama, RT-PCR ve Western blot yöntemleriyle 24 ineğe ait oviduktun istmus ve ampulla kısımları değerlendirilirken, Western blot analizinde bu hayvanların her iki oviduktu da kullanılarak NOS izoformlarının ekpresyonlarına bakıldı.L-arjininin istmusun longitidunal düz kas dokusunda geç diöstrüs ve folliküler evrede, sirküler düz kasta erken diöstrüste kasılım şiddetini değiştirmediği, diğer gruplarda arttırdığı gözlendi. Ampullanın longitidunal düz kasında geç diöstrüs, sirküler düz kasında ise geç diöstrüs ve folliküler evre gruplarında kasılım şiddetini değiştirmediği ancak diğer gruplarda arttırdığı belirlendi.İstmus ve ampullanın longitidunal ve sirküler düz kaslarına metöstrüs, geç diöstrüs ve folliküler evre gruplarında L-NAME sonrası uygulanan L-arjininin, kasılım şiddetini değiştirmediği veya arttırdığı, erken diöstrüste longitidunal düz kasta azalttığı, sirkülerde ise değiştirmediği izlendi. Bu dokularda MB sonrası uygulanan L-arjininin erken diöstrüs, geç diöstrüs ve folliküler evre gruplarında kasılım şiddetini değiştirmediği veya azalttığı, metöstrüste değiştirmediği veya arttırdığı gözlendi.SNP' in istmusun longitidunal düz kas dokusunda metöstrüs ve folliküler evre gruplarında kasılım şiddetini azalttığı, erken diöstrüste fark oluşturmadığı ve geç diöstrüs grubunda arttırdığı görüldü. İstmusun sirküler düz kasında metöstrüs, erken diöstrüs ve folliküler evre gruplarında kasılım şiddetini azalttığı, geç diöstrüste fark oluşturmadığı izlendi. Ampullanın longitidunal ve sirküler düz kaslarında metöstrüs ve folliküler evre gruplarında azalma izlenirken, erken ve geç diöstrüs gruplarında SNP' nin etkili olmadığı görüldü.İmmünohistokimyasal olarak tüm gruplarda istmus ve ampulladaki endoteliyal NOS (eNOS) ekpresyonu seroza, kas katmanı ve lamina propriadaki kan damarları endotelinde ve epitelyumda gözlendi. Nöronal NOS (nNOS)' un epitel hücreler ile seroza, muskuler katman ve lamina propriada bulunan sinir fibrillerinde pozitif boyama gösterdiği belirlendi. Epitel tabakada eNOS' un istmus ve ampullada metöstrüs grubunda şiddetli, folliküler evrede orta ve diğer gruplarda zayıf reaksiyon, nNOS' un metöstrüs ve folliküler evre gruplarında istmusta şiddetli, ampullada orta derece reaksiyon verdiği gözlendi. Sinir fibrilleri sıklıkla metöstrüs ve folliküler evre gruplarında pozitif boyama gösterdi. RT-PCR analizinde ise bütün gruplarda eNOS, nNOS ve iNOS izoformları belirlendi. Western Blot yönteminde nNOS için herhangi bir bulguya rastlanılmazken, eNOS ve iNOS proteinlerinin ipsilateral ve kontralateral olarak varlığı gözlendi.Sonuç olarak, ineklerde spontan ovidukt kasılımları üzerine NO' nun in vitro olarak bir etkisinin olmadığı, bunun nedeninin NOS enzim etkinliğinden kaynaklanmadığı, aynı zamanda hormonal durumun NOS enzim etkinliğini değiştirebileceği, NOS / NO sisteminin oviduktun kasılım mekanizmasında değil sekretörik ve siliar aktivitelerinde rol oynayabileceği kanısına varıldı.

The objective of this study was to determine the effect of nitric oxide (NO) on spontaneous contractility of oviduct of cows in different sexual cycle in vitro and to reveal the expression models of nitric oxide synthase enzymes.The oviducts (n:88) of 64 Holstein cows obtained from private slaughterhouse were evaluated. Animals were separated into four groups as metestrous, early diestrous, late diestrous and follicular phase, then blood samples were taken to define progesterone (P4) and NO concentration.Longitidunal and circular isolated strips of isthmus and ampulla of oviducts of cows (n:40) placing on the same side of ovary with luteal structure were prepared for isolated organ bath experiments. L-arginine, Nitro-L-arginine-metil-ester (L-NAME) + L-arginine and methylene blue (MB) + L-arginine were applied to the tissues to determine endogenous NO effect and sodium nitro prusside (SNP) was used to determine exogenous NO effect. The expression of NOS isoforms in isthmus and ampulla parts of oviducts of 24 cows were evaluated for immunohistochemical staining, RT-PCR and Western blotting, but also both oviducts of these cows were used for Western blotting.In isthmus, it was observed that L-arginine did not alter contractile tension in longitidunal smooth muscle tissues in late diestrous and follicular phase groups and in early diestrous in circular muscles, but raised in other groups. In ampulla, it was determined that contractile tension was not changed not only in longitidunal strips in late diestrous but also in circular smooth muscle tissues in late diestrous and follicular phase. In other groups, the contractile tension was increased.By using L-arginine applied after L-NAME, it was seen that contractile tension was not changed or increased in metestrous, late diestrous and follicular phase in longitidunal and circular smooth muscle tissues both in isthmus and ampulla. However, it was decreased in early diestrous in longitidunal strips but not changed in circular smooth muscle tissues. In addition, by using L-arginine applied after methylene blue (MB), the contractile tension was not changed or decreased in early, late diestrous and follicular phase, was not changed or increased in metestrous.In longitidunal smooth muscle tissues of isthmus, it was determined that contractile tension was decreased in metestrous and follicular phase groups, but was not changed in early diestrous and increased in late diestrous groups, by using sodium nitro prusside (SNP). Beside this, in circular smooth muscle tissues, contractile tension was decreased in metestrous, early diestrous and follicular phase groups and was not changed in late diestrous by SNP. In longitidunal and circular smooth muscle tissues of ampulla, SNP was not effective on contractile tension in early and late diestrous groups while the tension was decreased in metestrous and follicular phase groups by SNP.Immunohistochemically, in all groups endothelial NOS (eNOS) expression in isthmus and ampulla was observed in endothelium on blood vessels in serosa, muscular layer and lamina propria and epithelium. Neuronal NOS (nNOS) had a positive staining in epithelial cells and nerve fibres in serosa, muscular layer and lamina propria. In epithelial layer of isthmus and ampulla, it was seen that eNOS reaction was strong in metestrous, moderate in follicular phase and weak in other groups, while nNOS reaction was strong in isthmus and moderate in ampulla in metestrous and follicular phase groups. Positive staining of nerve fibres was observed mostly in metestrous and follicular phase groups. In all groups eNOS, nNOS and iNOS isoforms were detected by RT-PCR. In Western blotting, eNOS and iNOS proteins were evident in ipsi-contra lateral oviduct whereas nNOS was undetectable.In conclusion, it was suggested that NO had no effect on spontaneous oviduct contractility in cows in vitro, this effectiviness was not due to NOS enzyme activity however, hormonal status could change the NOS enzyme activity and NOS / NO pathway could play a role in secretory and ciliary functions, but not in contractility in oviduct.