Cloning, expression and sequencing of citrate synthase from Thermoplasma volcanium

Abstract

oz THERMOPLASMA VOLCANIUIVTUfi SİTRAT SENTAZ GENİNİN KLONLANMASI, EKSPRESYONU VE NÜKLEİK ASİT DİZİLİMİNİN BELİRLENMESİ Çekiç, Çağlar Master, Biyoteknoloji Bölümü Tez yöneticisi: Prof. Dr. Semra Kocabıyık Ortak Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Mahinur Akkaya January, 1 1 5 sayfa Bu çalışmada ilk defa, termoasidofilik bir arkea olan Thermoplasma (Tp.) volcanium` dan (Optimum gelişme sıcaklığı 60°C, ve optimum pH ise 2.0 dir.) sitrat sentaz geni klonlanarak nükleik asit dizilimi belirlenmiştir. Klonlama için PCR temelli bir yaklaşım izlenmiştir. Tp.volcaniurnwn kromozomal DNA'sından sitrat sentaz geninin amplifikasyonu sonucu 1161 bp büyüklüğünde yapısal gen içeren 1476 bp bir DNA bölgesi elde edilmiştir. PCR amplikonun, AU eşleşmesi ile pDrive vektöre bağlanmasından sonra oluşan rekombinant plazmitler E.coli TG-1 competan hücrelerine aktarılmıştır. Üç rekombinant arasından arasından seçilen E.coli pDriveCS-31, restriksiyon haritalaması ve DNA dizi belirlenmesi yolu ile karekterize edilmek üzere seçilmiştir. pDriveCS-31 plazmitinin membran blotu ile DIG ile markalanmış PCR ile çoğaltılmış sitrat sentaz gen probunun kullanıldığı Southern Blotlama ve Hibridizasyon, Tp.volcanium sitrat sentaz geninin £.coirde klonlandığını bir kez daha doğrulamıştır. Clustal W Version 1.82 programı kullanılarak Tp.volcanium sitrat sentazm amino asit dizisi, diğer arkea, bakteri veökaryotik sitrat sentaz dizileri ile eşleştirilmiştir. En yüksek dizi benzerliği (%87) Tp.volcanium ve Tp.acidophilum enzimleri arasında bulunmuştur. Domuz enzimi ile dizi homoloj isinin (18%) düşük olmasına karşm, bu enzimin katalitik aktiveteden sorumlu 1 1 amino asitinden 9 tanesi Tp.volcanium enziminde korunmuştur. Sitrat sentaz geninin E.colfde ekspresyonu kendi promotörünün kontrolü altında gerçekleştirilmiştir. Rekombinant enzim (386 aa) Reaktive Red 120 kolonu kullanılarak Affınite kromotografi ile homojen bir şekilde saflaştırılmıştır. Herbir alt ünitenin görünür moleküler ağırlığı yaklaşık 43 kDa olarak belirlenmiştir. Saflaştırılmış enzim klasik Michaelis-Menten kinetiğine uymaktadır. Asetil-CoA ve okzaloasetat için çizilen Lineweaver-Burk eğrilerinden sırası ile Km değerleri 5.15 uM ve 5.60 uM olarak, Vmax değerleri ise 1.74 umoles/ml/min ve 1.60 umoles/ml/min olarak hesaplanmıştır. Recombinant enzim termostabil olup, 85°C de 1 saat süresince aktivitesinin yaklaşık %80'i korunmuştur. Anahtar Kelimeler: Sitrat sentaz, Klonlama, Ekspresyon, Termostabilite, Termoaktivite, Thermoplasma volcanium vı

ABSTRACT CLONING, EXPRESSION AND SEQUENCING OF CITRATE SYNTHASE FROM THERMOPLASMA VOLCANIUM Çekiç, Çağlar M.S., Department of Biotechnology Supervisor: Prof. Dr. Semra Kocabıyık Co-Supervisor: Prof. Dr. Mahinur Akkaya January, 1 1 5 pages In this study first time, we have cloned and sequenced the citrate synthase gene from a thermoacidophilic archaeon Thermoplasma (Tp.) volcanium (Optimum growth temperature of Tp. volcanium is 60°C and optimum pH is 2.O.). For cloning we have followed a PCR based approach. Amplification of citrate synthase gene from chromosomal DNA of Tp.volcanium yielded a product of 1476 bp containing an open reading frame of 1161 bp comprising the structural gene. After ligation of the PCR amplicon to pDrive vector through AU complementation, recombinant plasmids were transferred into E.coli TG-1 competent cells. Out of three recombinants, E.coli pDriveCS-31 was selected for further characterization by restriction mapping and DNA sequencing. Southern Blotting and Hybridization using the membrane blot of pDriveCS-31 plasmid and DIG-labeled PCR amplified citrate synthase gene probe, also confirmed the cloning of Tp.volcanium citrate synthase gene in E.coli. Clustal W Version 1.82 was used for alignment of aminoacid sequence of Tp.volcanium citrate synthase with that of other archaeal, bacterial and eukaryotic citrate synthases. Thehighest sequence similarity (87%) was found between Tp.volcanium and Tp.acidophilum enzymes. Despite low sequence homology (18%) with the pig enzyme, of the 1 1 residues implicated in catalytic activity of the pig citrate synthase 9 were conserved in the Tp.volcanium enzyme. Heterologous expression of this citrate synthase gene in E.coli has been achieved under the control of its promoter sequences. The recombinant enzyme (386 aa) has been purified to homogeneity by affinity chromatography on Reactive Red 120 column. The subunit molecular size was estimated as 43 kDa. The purified enzyme followed classical Michaelis-Menten kinetics. The Km values of 5.15 uM and 5.60 uM, and Vmax values of 1.74 umoles/ml/min and 1.60 umoles/ml/min were calculated from Lineweaver-Burk plots for acetyl-CoA and oxaloacetate, respectively. The recombinant enzyme was thermostable and retained about 80% of the activity at 85°C after 1 hour. Keywords: Citrate Synthase, Cloning, Sequencing, Expression, Thermostability, Thermoactivity, Thermoplasma volcanium. IV