Clostridium perfringens epsilon toksoid içeren aşılarda mdck hücre hatlarında toksisite analizi ile potensin belirlenmesi

Abstract

Clostridium perfringens tip B ve tip D tarafından salgılanan epsilon toksin başta koyun ve keçilerde, daha az olarak da sığırlarda enteroroksemiye neden olan ve bütün dünyada yaygın görülen bir enfeksiyondur. Hastalığın hızlı ve şiddetli seyretmesi nedeniyle mücadelede aşılamalar ön plana çıkmaktadır. Genellikle farklı klostridial komponentlerin bir araya gelmesiyle polivalan hazırlanmış bu grup aşıların potens testleri, çok sayıda deney hayvanı kullanımını esas alan Toksin Nötralizasyon testi (TNT) ile yapılmaktadır. TNT'nin hayvan refahı ve metot doğrulama çalışmaları açısından dezavantajları olan bir test olması nedeniyle, uluslar arası standartlarda revizyonlar yapılması da dahil, alternatif metotların geliştirilmesi ve uygulanması teşvik edilmektedir. Bu amaçla serolojik tabanlı farklı in vitro metotlar uygulanabilmekle birlikte, bu testlerde kullanılan antijen, antikor ve referans standartların saflaştırılması ve standardizasyonu halen önemli bir sorun olarak durmaktadır. Bu bakımdan hücre kültürü analizleri klostridial aşıların potens testlerinde olası alternatifler içinde görülmektedir.Bu gereklilikler göz önünde tutularak epsilon toksoid içeren aşılar ile immunize edilen tavşan serumlarında fare TNT ile Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücre kültürlerinde sitotoksisite analizi ile antitoksin miktarları belirlenmiştir. İki metodun sonuçları arasında yüksek bir korelasyon (r=0.952, p<0.01, n=21, çift kuyruklu) ve iyi bir lineer ilişki (R2=0.906; Y=1.007*X + 0.994) gözlenmiştir. Epsilon toksinle muamele edilen hücrelerde toksin konsantrasyonuna eşdeğer hücre ölümleri gerçekleşmiştir. Ayrıca hücre kültürü analizlerinde yalancı pozitif reaksiyon görülmemiştir. Bu sonuçlar Clostridium perfringens epsilon toksoid içeren aşıların potens testlerinde, in vivo fare TNT yerine, in vitro MDCK hücre hattı seronötralizasyon analizinin başarıyla kullanılabileceğini göstermektedir.

Epsilon toxin generated by Clostridium perfringens types B and D is the cause of enterotoxemia disease which is widely seen around the world in sheep, goats and to a lesser ETXent cattle. As it has a fast and severe course, vaccination has priority in disease prevention. Potency testing of these polyvalent vaccines with different Clostridial components are carried out with Toxin Neutralisation Test (TNT) using a large number of laboratory animals. As TNT has disadvantages regarding animal welfare and method validation studies, development and application of alternative methods including revisions in international standards are recommended. Although various serology based in vitro tests may be used for this purpose, purification and standardization of antigen, antibody and reference standards used in these tests still remain an important problem. From this perspective, cell culture analyses are conferred to be among possible alternatives for the potency testing of Clostridial vaccines.Taking these necessities into consideration, antitoxin amounts were determined with mouse TNT and cytotoxicity test in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell cultures in sera from rabbits immunized with vaccines containing epsilon toxoid. Both methods showed high correlation (r=0.952, p<0.01, n=21, double tailed) and a good linearity (R2=0.906; Y=1.007*X + 0.994) between results. Cell deaths equivalent to toxin concentration were observed in the cells exposed to epsilon toxin. Also, there were no false positive reactions in cell culture analyses. These results show that in vitro MDCK cell line seroneutralization analysis can be successfully used instead of in-vivo Mouse TNT for the potency testing of vaccines containing Clostridium perfringens epsilon toxoid.