Kainik asit ile hücrelerde eksitotoksisite modelinin oluşturulması ve glutamat taşıyıcısı-1 (GLT-1)`in incelenmesi

Abstract

Eksitotoksisite, MSS' nin moleküler işleyişinde sinaptik boşluğa salınan glutamatın, anormal ve aşırı artışı olarak tanımlanan bir durumdur. Çoğunlukla glutamatı sinaptik boşluktan temizleyecek glutamat taşıyıcılarının, glutamatın taşınımını gerçekleştirememesi sonucu gerçekleşir ve hücre ölümüyle sonuçlanır. Kainik asit, glutamat reseptör agonisti olarak bilinen güçlü bir nörotoksindir ve nöronal hasar oluşumu ve gelişimini tetikleyerek eksitotoksisiteye neden olur. MSS normal işleyişinde, presinaptik nöronlardan sinaptik boşluğa salınan glutamatın, astrositlerin ve postsinaptik nöronların membranlarında bulunan glutamat taşıyıcıları tarafından hücrelere alımı ve sinaptik boşluktan temizlenmesi gerçekleştirilmektedir. En fazla glutamat taşınımı GLT-1 ile sağlanmaktadır. Bu çalışmada; nöroblastoma ve glia hücrelerinde, kainik asit ile eksitotoksisitenin indüklenmesi sonucu GLT-1'in ifadesinde meydana gelen değişiklikler ve bu taşıyıcıların normal süreçteki glutamat taşınımında önemi gösterilmek istenmiştir. MTT Assay Testi ile 50, 200, 500, 1000 µM dozlarda kainik asit, N2A ve IHA hücrelerine verilerek 24 saat sonunda hangi dozda eksitotoksisite durumu ile hücre ölümü gerçekleştiği belirlenmiş, belirlenen dozda petrilerde kültüre edilen hücrelere kainik asit verilmiştir. 24 saat inkübasyon sonrası kontrol ve kainik asit verilen hücrelerden protein ekstraktları elde edilmiş ve protein miktar tayini gerçekleştirilmiştir. Western Blot tekniği kullanılarak GLT-1 taşıyıcısının protein düzeyindeki ifadesine bakılmıştır. Protein ifadesi belirlenemeyen hücrelerden RNA izolasyonu gerçekleştirilmiş, cDNA üretilmiş ve RT-PCR tekniği kullanılarak GLT-1'in mRNA düzeyindeki ifadesi kontrol ve kainik asit verilen örnekler arasında karşılaştırılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda, kullanılan N2A hücre hattı için kainik asit ile indüklenen GLT-1 protein ifadesi Western Blot tekniği ile görüntülenemedi. Bu nedenle, kontrol ve kainik asit verilen N2A hücrelerinden RNA elde edilerek GLT-1'in mRNA düzeyi araştırıldı. GLT-1'in mRNA düzeyindeki ifadesinin, kainik asit verilmiş hücrelerde kontrole oranla arttığı gözlemlendi. Bununla birlikte, glia hücrelerinde yapılan çalışmalarda ise kainik asit verilen hücrelerin GLT-1 protein seviyesinin kontrol hücrelerine göre arttığı gözlemlendi. Her iki hücre türünde alınan sonuçlar birbiri ile uyumlu olup eksitotoksisite durumunda, sinaptik boşlukta fazla bulunan glutamatı toplamak için GLT-1 seviyesinde beklenen artışın görüldüğü bulundu.

Excitotoxicity is the abnormal and excessive increase of the neurotransmitter glutamate released into the synaptic space in the CNS. Usually, this condition occurs due to the dysfunctioning of the glutamate transporters which clear glutamate from the synaptic space, resulting in cellular death. Kainic acid is a potent neurotoxin which is known as a glutamate receptor agonist and it induces neuronal damage, leading to excitotoxicity. Normally, glutamate is released from the presynaptic neurons to the synaptic cleft and taken up by the glutamate transporters on the postsynaptic neurons or astrocytes. The majority of the glutamate transport is carried out by GLT-1. In this study; by inducing excitotoxicity via kainic acid in N2A and IHA cells, the changes in the expression of GLT-1 and the importance of glutamate transporters in the normal process of glutamate transport were tried to be shown. 50,200,500,1000 µM doses of kainic acid were applied to N2A and IHA cells for 24 hours, and the cell viability was assessed with MTT assay. A specific dose was determined, kainic acid was applied to the cultured cells in petri dishes. After 24 hour incubation, protein extracts were made from both kainic acid treated and control cells and the concentrations of the protein extracts were quantified. The expression of GLT-1 transporter at the protein level was examined using the Western Blot technique. For the samples whose protein expression could not be determined by Western Blot technique, RNA isolation was performed from the cells, cDNA was produced and the expression of GLT-1 at mRNA level using RT-PCR technique was carried out comparing kainic acid treated and control cells. A a result of the studies, kainic acid-induced GLT-1 protein expression could not be visualized by Western Blot technique for the N2A cell line used. Therefore, mRNA level of GLT-1 was investigated by obtaining RNA from kainic acid treated or control N2A cells and it was observed that the expression of GLT-1 mRNA level increased in kainic acid treated celss compared to control cells. It was observed that GLT-1 protein levels were increased in kainic acid treated glial cells compared with control cells. The results obtained in both cell types were consistent with each other and it was found that, in the case of excitotoxicity, the expected increase in GLT-1 was observed to collect the excess glutamate.