Farelerde in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferinin fötal akciğer dokusunda notch sinyal yolağı hedef genlerinden HEY1 ve SKP2 genlerinin ekspresyonu üzerine etkisi

Abstract

Sunulan tez çalışmasında, in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi işlemlerinin fötal (E18.5) akciğer dokusunda Notch sinyal yolağı hedef genlerinden Hey1 ve Skp2 genlerinin ekspresyonu üzerine herhangi bir etkisinin olup olmadığının incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada bir Kontrol grubu ve bir Deneme grubuna yer verilmiştir. Kontrol grubunu oluşturan fötal akciğer doku örnekleri, PMSG+hCG uygulaması yapılmamış olan dişilerin, aynı yaştaki erkeklerle çiftleştirilmelerinden elde edilen fötuslardan; Deneme grubunu oluşturan fötal akciğer doku örnekleri ise PMSG+hCG uygulamasını takiben çiftleştirilen dişilerden elde edilen döllenmiş yumurta hücrelerinin (zigot) atmosferik oksijen konsantrasyonunda büyütülmesiyle elde edilen blastosistlerin yalancı gebelere transferi sonucunda elde edilen fötuslardan izole edilmiştir. Akciğer dokularında, Hey1 ve Skp2 proteinlerinin ekspresyonlarını belirlemek amacıyla immunohistokimya/immunofloresan boyama teknikleri uygulanmıştır. Hey1 ve Skp2 genlerinin transkripsiyonel ve translasyonel düzeylerde ekspresyonlarının belirlenmesinde kantitatif real-time PCR (qRT-PCR) ve western blot yöntemlerinden yararlanılmıştır. İmmunohistokimya/immunofloresan boyama sonuçları, Kontrol ve Deneme gruplarına ait akciğer dokularında Hey1 ve Skp2 proteinlerinin benzer bir ekspresyon profiline sahip olduklarını göstermiştir. Birleştirilmiş total RNA örneklerinde TaqMan probları kullanılarak gerçekleştirilen qRT-PCR analizlerinden elde edilen sonuçlar, Kontrol grubu ile kıyaslandığında, Deneme grubunda Hey1 mRNA ekspresyonunun 3,30 kat azaldığını; Skp2 mRNA ekspresyonunun ise 8,53 kat arttığını göstermiştir. Aynı örneklerde, SYBR Green metodu ile gerçekleştirilen qRT-PCR analizleri, Hey1 mRNA ekspresyonunun 4,39 kat azaldığını; Skp2 mRNA ekspresyonunun ise 10,57 kat arttığını göstermiştir. Ayrıca, SYBR green qRT-PCR yöntemi ile bireysel örneklerde yapılan analizler, Kontrol grubu ile kıyaslandığında Deneme grubunda Hey1 mRNA ekspresyonunun 3,88 kat azaldığını; Skp2 mRNA ekspresyonunun ise 7,57 kat arttığını göstermiştir. Western blot analizleri, Kontrol grubu ile kıyaslandığında, Deneme grubunda Skp2 proteininin ekspresyon düzeyinin 2,34 kat arttığını; istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte Hey1 proteininin 1,17 kat azaldığını göstermiştir. Elde edilen veriler, Hey1 ve Skp2'nin farelerde fötal akciğer dokusunda belirli hücreler tarafından eksprese edildiğini göstermekte olup, in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi işlemlerinin Hey1 ve Skp2'nin transkripsiyonel/translasyonel ekspresyonlarını değiştirerek fötal akciğer dokusunun gelişimini etkiliyebileceğini düşündürmektedir.

The aim of the present study was to investigate whether or not in vitro embryo culture and embryo transfer have any effect on the expression of Notch signaling target genes Hey1 and Skp2 in the fetal mouse lung tissue (E18.5). The study included one Control group (CG) and one Experimental group (EG). Lung tissues constituting the CG were harvested from fetuses of naturally ovulating females. The Experimental group consisted of fetuses generated by transfer of in vitro-developed blastocysts obtained through in vitro culture of zygotes. Immunohistochemistry/immunofluorescence staining techniques were used to reveal Hey1/Skp2 immunopositive cells. qRT-PCR and western blot methods were used to quantify the expression of Hey1/Skp2 genes. The results demonstrated that Hey1/Skp2 genes have a similar expression pattern in both groups. Results from TaqMan and SYBR Green qRT-PCR analyses performed on pooled total RNA samples indicated that Hey1 mRNA expression is decreased 3.30-fold and 4.34-fold, whereas the expression of Skp2 is increased 8.53-fold and 10.57-fold in the EG compared to the CG, respectively. SYBR Green qRT-PCR analyses performed on individual total RNA samples demonstrated that Hey1 mRNA expression is decreased by 3.88-fold; whereas Skp2 mRNA expression was increased by 7.57-fold in the EG compared to the CG. Western blot analysis showed that the expression of Skp2 protein was increased by 2.34-fold in the EG compared to the CG. On the other hand, there was a 1.17-fold decrease in the expression of Hey1 protein in the lung tissue of fetuses comprising the EG. Taken together, data gathered in the present study indicate that Hey1/Skp2 are specifically expressed by certain cells in fetal mouse lung tissues and further suggest that in vitro embryo culture and embryo transfer might affect lung development in the fetal period by altering the expressions of Hey1/Skp2 genes at transcriptional/translational levels.