Visualization of interactions between fluorescently tagged G protein α11, α12/13 subtypes and adenosine 2A, dopamine 2 or homodimer adenosine 2A/2A receptors
- Global styles
- Apa
- Bibtex
- Chicago Fullnote
- Help
Abstract
G-proteine kenetli reseptörler (GPKR), G proteinlerle etkileşime girerek hücre dışısinyalleri, hücre içi cevaplara dönüştüren hücre zarı moleküllerine ait büyük bir reseptörailesidir. G proteinleri, ikincil mesajcılar ve sinyal proteinleri ile farklı sinyal yolaklarınıdüzenleyen moleküler düzenleyicilerdir. Adenozin 2A (A2A) ve Dopamin (D2)reseptörleri de G-proteine kenetli reseptör (GPKR) ailesine aittir ve daha çokstriatopallidal γ-aminobutyric acid (GABA) içeren nöronlarda bulunur. Bu nedenle bureseptörlerle ilgili problemler şizofreni, Parkinson gibi pisikolojik hastalıklarlabağlantılıdır.Adenozin A2A reseptörü, nörotransmisyonu, kardiyovasküler sistemi ve immun sisteminidüzenler. Diğer bir yandan, Dopamin reseptörü ise hareket, gıda alımı, öğrenme, duyguve davranış durumlarını kontrol eder. Yapılan çalışmalara göre A2A ve D2 reseptörlericAMP seviyesini Gαs ve Gαi ptoteinleri aracılığıyla adenylyl siklazı uyararak ya da engelleyerek değiştirmektedir. Dopamin 1 (D1) ve Dopamin 2 (D2) reseptörleriheterodimer oluşturduklarında Gαq11 sinyal yolu tercih edilerek PIP2 ve DAG ikincilmesajcıları active ederler; ancak Gαq11 proteinin A2A, D2 ve A2A/A2A homodimerireseptörleri ile etkileşimi rapor edilmemiştir. GPCR'lar aynı zamanda Rho kinazinaktive edilmesiyle aktin hücre iskeleti ve hücre göçünü düzenleyen Gα12/13 sinyal yolunukullanır. Gα12/13 mutant hücrelerin aşırı nöral göçe ve serebral korteksin fonksiyonbozukluğuna neden olduğu tespit edilmiştir. Buna ek olarak, hücre göçü A2A reseptörüile pozitif, D2 reseptörü ile negatif bir şekilde etkilenmektedir. Ancak, Gα12/13proteinlerinin A2A ve D2 reseptörleri ile farklı bir sinyal yolu olarak etkileşimi olupolmadığı bilinmemektedir.Çalışmanın amacı; Gαq11-A2A, Gαq11-D2R, Gαq11-A2A/A2A; Gα12/13-A2A, Gα12/13 -D2R veGα12/13 -A2A/A2A arasında fiziksel etkileşimi Fluoresans Rezonans Enerji Transfer(FRET) metodu ile tespit etmektir. Bu amaçla G-proteinlerin α alt ünitesi (Gα11, Gα12 veGα13) mCherry veya EGFP floresant proteinleri ile beş farklı konumdan işaretlenmiş;reseptörler ise bölünmüş EGFP fragmenti ve EGFP floroforları ile işaretlenerek farkıkombinasyonlarda Mus musculus Neuroblastoma-2a (N2a) hürelerine transfekteedilmiştir. Proteinler arası etkileşimin görülmesi için spinning disk konfokal mikroskobuile görüntüler alınmış ve FRET verimi ImageJ programının pixFRET eklentisi ilehesaplanmıştır. Gα11+mCherry ve D2R+EGFP ile Gα13+mCherry ve A2A+EGFPtransfeksyonu gerçekleşen N2A hücrelerinin hücre membranından gelen yüksek FRETsinyali tespit edilmiştir. Gα13-D2R, Gα11-A2A ve Gα11-A2A/A2A çiftleri, Gα11-D2R veGα13-A2A protein çiftlerine göre daha az sinyal vermiştir. Bu proteinlerin kesin olaraketkileşime girdiğini belirlemek için daha fazla deneyle desteklenmesi gerekmektedir.Diğer bir yandan, Gα12-A2A ve Gα13-A2A/A2A çiftleri ise background sinyaldenayrılamayacak kadar düşük FRET sinyali vermiştir. Bu da etkileşimin olmadığınıngöstergesidir. Bu çalışmada olduğu gibi protein etkileşimlerinin çalışılması, sinyalyolaklarının daha iyi anlaşılmasına ve ileride bunların yeni tedavi modelleri ile ilaçadaylarının keşfedilmesine yardımcı olabilir. G-Protein-coupled receptors (GPCRs) belong to one of the largest family of cell surfacereceptors, which transmit extracellular signals to intracellular responses by interactingwith G- proteins. The G proteins are known as molecular switches that regulatesdifferent pathways via control of secondary messengers and signaling proteins.Adenosine 2A (A2A) and Dopamine 2 (D2) receptors belong to G-Protein-coupledreceptors (GPCRs) family and are located mostly in striatopallidal γ-aminobutyric acid(GABA) containing neurons. Therefore, problems related to these receptors areassociated with physiological disorders such as schizophrenia, and Parkinson disease.A2A receptors regulate neurotransmission, cardiovascular system and immune response;On the other hand, D2 receptors modulate the regulation of locomotion, food intake,learning, emotion and behavior. Studies showed that, A2A and D2 receptors change thecAMP level by stimulating or inhibiting adenylyl cyclase via interacting with Gαs andGαi proteins. When D1 and D2 receptors heterodimerize, Gαq11 signal pathway waspreferred and activate PIP2 and DAG secondary messengers. However, interactionbetween Gαq11 protein and A2A, D2R or A2A/A2A homodimer is not reported. GPCRscould also signal through Gα12/13 which regulates actin cytoskeleton and cell migrationthrough activation of Rho kinases. It is established that, Gα12/13 mutant cells showneuronal over migration and dysfunction at cerebral cortex. In addition, cell migration iseffected positively by A2A receptor activation while it could be negatively regulated byD2R receptor activation. However, it is not clear if Gα12/13 proteins are interacting withA2A and D2 receptors triggering related pathways.The aim of this study is to analyze possible physical interaction between Gαq11-A2A,Gαq11-D2R, Gαq11-A2A/A2A; Gα12/13-A2A, Gα12/13 -D2R and Gα12/13 -A2A/A2A usingFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) method. For this purpose, G-protein αsubunits (Gα11,G α12 and Gα13) were labeled with mCherry or EGFP fluorescent proteinsfrom five different internal locations; receptors were labelled with split-EGFPfragments, and full length EGFP fluorophore, and then transfected to Mus musculusNeuroblastoma-2a (N2a) cells as various combinations. To analyze the possibleinteractions, images were taken via spinning disc confocal microscopy and FRETefficiency was calculated by using pixFRET Plugin for ImageJ software. Imagesobtained from Gα11+mCherry and D2R+EGFP transfected N2a cells; Gα13+mCherry andA2A+EGFP have high FRET signal mostly located on cell membrane. Gα13-D2R, Gα11-A2A and Gα11-A2A/A2A pairs had lower signal than Gα11-D2R and Gα13-A2A pairs.Further experiments are necessary to prove an interaction between these pairs if it everexists. On the othe hand Gα12-A2A and Gα13-A2A/A2A pairs had very low signal thatwas impossible to difrentiate from background signal indicating a lack of interaction.Protein interaction studies like the ones detailed in this study could help us understandsignal transduction pathways much better, thus will be useful to design new treatmentmodels and discover drug candidates in future.
Collections