Hb-D Los Angeles`ın ayırıcı molekülsel tanısı

Abstract

7. ÖZET Anormal hemoglobinler ve talasemiler, günümüzde en iyi bilinen ve yaygın biçimde gözlenen kalıtsal kan hastalıklarından bir tanesidir. Anormal hemoglobinlerin sayıca çok ve farklı türlerinin bulunduğu çeşitli araştırıcılar tarafından bildirilmiştir. Ülkemizde de halen bilinen anormal hemoglobin sayısı 42 olarak bildirilmektedir. Molekülsel tamda, hemoglobin türünün doğru biçimde tanımlanması önemlidir. Anormal hemoglobinlerin molekülsel tanısında; protein ve gen düzeyinde birçok yöntem uygulanmaktadır. Bu yöntemler arasında, hemoglobin elektroforezi, kromatografik yaklaşımlar, PCR {polymerase chain reactionfa dayalı mutasyon tanımlama çalışmaları yer almaktadır. Birçok hemoglobin türü, birbirlerine benzer davranışlar sergilediklerinden kesin tanımlama yöntemi DNA dizi analizidir. DNA dizi analizi ise pahalı ve deneyimli kullanıcı gereksinimi nedeni ile her laboratuarda rutin biçimde uygulanamamaktadır. SPR (surface plasmon resonance) spektroskopisi; optik ilkelere dayalı biçimde, enzim, radyoaktif madde gibi herhangi bir işaretleyiciye gereksinim duymaksızın, iki molekül arasındaki etkileşimin doğasına ilişkin bilgi verebilen güncel bir yaklaşımdır. Tez çalışmamızda model olarak Hb D-Los Angeles seçilmiştir. Bu modelin seçilmesindeki temel yaklaşım, yöremizde yaygın olarak bulunması ve Hb S ile klasik yöntemler kullanıldığında kolaylıkla kanşünlabilir olmasıdır. Çalışmamızda biyotinli primer ile elde edilen PCR ürünleri üzerindeki mutasyon odağına Eco RI enziminin bağlanmasına dayalı bir yöntem izlenmiştir. Eco RI enzimi; Hb D-Los Angeles mutasyonu olan 121. kodondaki değişiklik (GAA>CAA) nedeni ile, kesim yeri olan GAATTC dizisini tamyamamaktadır. Elde edilen verilere göre SPR spektroskopisi yöntemi, Hb AD-Los Angeles ile Hb AA arasındaki değişikliği algılayabilmektedir. SPR analizinin kısa sürede yapılması göz önüne alındığında, yöntemin geliştirilerek rutin uygulamada kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. 38

8. ABSTRACT Abnormal hemoglobins and thalassemias are one of the well studied hereditary- blood diseases. These hemoglobin disorders are distributed around the world populations as well as in Mediteranean countries including Turkey. In Turkey, about 42 abnormal hemoglobins were reported so far. Molecular diagnosis of abnormal hemoglobins needs more than one diagnostic experiments, like electrophoretic, chromatographic and DNA-PCR (polymerase chain reaction) based approaches. Since the presence of many abnormal variants which behaves like each other, laboratory diagnosis has many complications. Although DNA sequencing approach gives the correct results, it can not be applied in all laboratories working for routine purposes. SPR (surface plasmon resonance) spectroscopy; is a novel approach producing an important data for the biomolecular interaction without the needs of labelling with enzymatic and radioactively marked probes. In our study; the selected model system is Hb D-Los Angeles which has high incidence in our province of Denizli-Turkey. Hb D-Los Angeles behaves like Hb S leading to misdiagnosis in routine screening. We used biotinylated PCR products to be interacted by Eco RI restriction enzyme. Hb D-Los Angeles mutation localizes at codon 121 leading to mutational change of GAA>£AA. Eco RI recognizes the sequence of GAATTC which corresponds to the beta globin codons 121 and 122. In case Hb D-Los Angeles mutation the restriction site for Eco RI changes. Eco RI cannot digest due to this change occurred at codon 121. According to our results; SPR analyses can differentiate the Hb D-Los Angeles mutation, successfully. We conclude that SPR analyses can be used in routine screening for the abnormal hemoglobins at gene level. 39