İn vitro endokondral kemikleşme sürecinde Natriüretik peptid reseptör-B (NPR-B) ve C-tipi natriüretik peptid (CNP) Ekspresyon ve fonksiyonlarının incelenmesi

Abstract

Ekstremitelerimizdeki uzun kemikler endokondral kemikleşme yolu ile oluşurlar. Bu mekanizmada uzun kemikler, gelişimleri sırasında kemik dokuya model olusturacak olan geçici kıkırdak doku oluşumuna ihtiyaç duyarlar. Dolayısı ile kıkırdak doku gelişimi, vertebralıların embriyonik ekstremite gelişimlerinde önemli bir morfogenetik aşamadır. Genel olarak endokondral kemikleşme mekanizması, ekstremitelerdeki mezenşim orijinli hücrelerin kondrositlere dönüşümlerini, bu kondrositlerin proğramlanmış ve yapılandırılmış bir sistem ile matürasyonlarını ve takip eden dönemde de bu yapıların yerlerini kemik doku elemanlarına bırakmalarını içerir. Bu sistem son derece koordine ve sıkı embriyonik-genetik kontrol mekanizmalari altında gelişimini tamamlar. Bugüne kadar ortaya konmuş pek çok kontrol mekanizmalarından son dönemde ön plana çıkanlardan birisi de C tipi natriüretik peptit (CNP) ve Natriüretik peptit reseptör-B (NPR-B) yolu ile aktive olan sinyal yoludur. NPR-B proteininin fonksiyon kaybına yol açan mutasyonları akromezomelik displazi tip maroteaux (AMDM; OMIM no. 602875) adı verilen osteokondrodisplaziye yol açar. Ancak AMDM'li hastaların endokondral gelişim süreçlerini yansıtan kemik büyüme plağı histolojilerinin incelenmesi mümkün olmadığından, CNP/NPR-B sinyal yolunun kondrogenez ve kemik gelişimi üzerine olan olası etkileri ve etki mekanizmalarını anlayabilmek için in vivo ve in vitro model sistemlere ihtiyaç duyulmaktadır.Bu projede, tavuk embriyolarından sağlanan, son farklılaşmaya uğramamış ekstremite tomurcuğu kökenli mezenşimal kök hücreler kullanılarak elde edilen primer hücre kültür ortamlarında, CNP/NPR-B sinyal yolunun endokondral kemikleşme sürecindeki hücre proliferasyonu, mezenşimal yoğunlaşma, kondrojenik farklılaşma, matürasyon, hipertrofi ve hücre dışı matriks sentezi fazlarındaki olası rolünün moleküler düzeyde incelenmesi amaçlanmıştır. Sonuçlarımız, in vivo endokondral kemikleşme sürecinde gözlenen fazların tümünün bu model sistemde in vitro olarak taklit edilebildiğini, ve her bir faza spesifik belirleyici özellikte moleküllerin (mezenşimal yoğunlaşma fazına spesifik N-cadherin, kondrojenik farklılaşma fazına spesifik kollajen tip II, ve matürasyon, hipertrofi fazına spesifik kollajen tip X) mRNA düzeyinde ekspresyonlarını göstermiştir. Dolayısı ile çalışmalarımıza zemin hazırlayacak olan in vitro bir model sistem kurulmuştur.Bir sonraki aşamada, önce insan CNP proteininin tavukdaki homoloğu olan CNP-3'ün ve bu sinyal proteininin reseptörü olan NPR-B'nin tavuk ekstremite gelişimi sürecindeki in vivo mRNA ekspresyon profili incelenmiştir. Sonuçlar, gerek CNP-3'ün gerekse NPR-B'nin mRNA düzeyinde incelediğimiz evre 18 ile 35 (Hamburger ve Hamilton'a göre tavuk embriyosu evrelemesi) arasındaki tüm evrelerde eksprese edildiğini göstermiştir. Bu süreç içerisinde her iki molekülün mRNA ekspresyon düzeyleri de ilki evre 23-24'te, ikincisi evre 30-31'de olmak üzere iki yükseliş dönemi göstermiştir. Bu evreler sırası ile in vivo pre-kondrojenik mezenşimal yoğunlaşmaya ve kondrojenik matürasyon-hipertrofi'nin tetiklenme dönemlerine karşılık gelmektedir. Aynı inceleme in vitro kültür ortamlarında tekrarlandığında her iki molekülün kollajen tip X ile paralel ekspresyon artışı gösterdikleri gösterilmiştir.Kültür ortamları 10-7 M CNP (insan orijinli) ile muamele edildiğinde karşımıza dört önemli sonuç çıkmıştır. Bunlar: 1) Kondrogenez ve glikozaminoglikan sentezi artmıştır, 2) Yoğunlaşma fazının sonunda ekspresyonunda azalma beklenen N-cadherin'in mRNA düzeyi artmıştır ve dolayısı ile mezenşimal yoğunlaşmada artış gözlenmiştir, 3) Kondrojenik matürasyon ve hipertrofi fazında kollajen tip X ekspresyonunda anlamlı bir artış gözlenmiştir, ve 4) Tüm bu artış yönündeki bulgulara rağmen kondrojenik değişimi gösteren kollajen tip II mRNA ekspresyonunda anlamlı bir değişim gözlenmemiştir. Bu bulgular olası fonksiyon yönünden bakıldığında in vivo ekspresyon profillerinde gözlenen pik evreleri ile de uyumludur.Sonuç olarak çalışmamız, CNP-3/NPR-B sinyal yolunun kondrogenezi pozitif yönde tetikleyen bir sinyal yolu olarak fonksiyon gördüğünü, etkisini de özellikle mezenşimal yoğunlaşmayı, glikozaminoglikan sentezini, ve kondrojenik matürasyon ve hipertrofi fazlarını uyararak gerçekleştirdiğini göstermiştir.Anahtar kelimeler: CNP, CNP-3, NPR-B, Endokondral kemikleşme, kondrogenez.

The bones of the limb form through endochondral ossification, a process involving a cartilage intermediate. Thus, chondrogenesis is an important morphogenetic step in the development of vertebrate limb. The overall process consists of a highly coordinated and orchestrated series of events involving the commitment and differentiation of limb mesenchymal cells to chondrocytes, which undergo programmed and structured maturation and subsequent replacement by the bony elements. Embriyonic cartilage development has been shown to be under the regulation of a number of factors. Recently, C type natriuretic peptide (CNP) and its receptor natriuretic peptide receptor-B (NPR-B) stimulated signaling pathway has been implicated in the regulation of limb chondrogenesis. A condition known as acromesomelic dysplasia, type Maroteaux (AMDM; OMIM no. 602875) is an autosomal recessive skeletal dysplasia caused by loss-of-function mutations in the NPR-B gene. This finding clearly implicates a role for the natriuretic peptide signaling in the regulation of endochondral ossification. However, in vivo and in vitro model systems are necessary to further investigate the specific mechanism(s) of action of this signaling pathway in endochondral ossification.The objective of this study was to further dissect out the implication of the CNP-3/NPR-B signaling in the process of chick limb mesenchymal chondrogenesis, and to identify the specific phase(s) of this process that CNP-3/NPR-B signaling is putatively involved in. Thus, the correlation of the expression patterns of CNP-3 and NPR-B with those of known markers of mesenchymal condensation (N-cadherin), chondrogenic differentiation (collagen type II), and maturation and hypertrophy (collagen type X) has been analyzed on the basis of RT-PCR at mRNA level in chick limb mesenchymal micromass cultures. In addition, the chondrogenic response to CNP treatment in these cultures was analyzed on the basis of alterations at the mRNA level of above-mentioned molecules involved in specific phases of this process.Results revealed CNP-3 and NPR-B expression in the chick limb bud making stage-specific peak levels first at Hamburger-Hamilton stage 23-24, and second at stage 30-31, corresponding to pre-chondrogenic mesenchymal condensation and initiation of chondrogenic maturation-hypertrophy in vivo, respectively. CNP-3 and NPR-B expression in vitro increased parallel to collagen type X expression, but not to that of collagen type II. Treatment of cultures with CNP significantly increased N-cadherin, and collagen type X expression, glycosaminoglycan synthesis and chondrogenesis. Collagen type II expression was not significantly affected.Thus, results implicated CNP-3/NPR-B signaling in pre-chondrogenic mesenchymal condensation, glycosaminoglycan synthesis and late differentiation of chondrocytes in the process of endochondral ossification.Key words: CNP, CNP-3, NPR-B, Endochondral ossification, chond rogenesis.