Sıçan koroner mikrovasküler endotel hücre kültüründe rho/rho-kinaz yolağı ve nitrik oksid ilişkisi

Abstract

Bu çalışmada sıçan koroner mikrovasküler endotel hücrelerinde Rho/Rho-kinaz yolağı ve nitrik oksit ilişkisi araştırıldı. Bu amaçla sıçan koroner mikrovasküler endotel hücreleri kültüre edildi.Kültüre edilen sıçan koroner mikrovasküler endotel hücrelerinde nitrik oksit (NO) vericileri, gliseril trinitrat (GTN, 10-7 M-10-8 M), sodyum nitroprussiyat (SNP, 10-7 M-10 -8 M), DETA-NO (10-5 M-10-6 M) ve NaNO2 (10-3 M-10-4 M) ile intrasellüler kalsiyum düzeyini yükselterek endotelyal hücrelerde NO sentezini ve salıverilmesini artıran kalsiyum iyonofor, A-23187'nin (10-7 M ve 10-6 M) bazal şartlarda ve trombin varlığında Rho-kinaz (ROCK) enziminin (ROCK-1 ve ROCK-2 izoformlarının) ekspresyonları üzerindeki etkisi araştırıldı.Çalışmada Wistar türü sıçanlar kullanıldı. Kalpler Langendorff kalp perfüzyon sistemine asılarak koroner mikrovasküler endotel hücreleri elde edildi. Hücreler kültür flasklarına ekilerek 37ºC'de %5 CO2'li ortamda inkübe edildi. Konfluent olan flasklar pasajlanarak çoğaltıldı.3. pasaj koroner mikrovasküler endotel hücreleri, deneylerden 24 saat önce bölünmeleri durdurulup NO donörleri, NO sentezi ve salıverilmesini artıran ilaçlar ve Rho-kinaz enzim inhibitörü Y-27632 ile inkübe edildi.İnkübasyon sonrası Y-27632 ile inkübe edilen flaskların mediumları alınarak nitrit-nitrat düzeyleri Griess yöntemiyle ölçüldü. Diğer ilaçlarla inkübe edilen flasklardaki hücreler ise homojenize edilerek Western-Blot yöntemi ile ROCK (ROCK-1 ve ROCK-2) enzim ekspresyon düzeyleri ölçüldü.Sonuç olarak, NO donörleri ve NO sentezini artıran A-23187, koroner mikrovasküler endotel hücrelerinde kontraktil bir protein olan Rho-kinaz enziminin ekspresyonunu azalttı. Bu bulgu, NO donörleri ve sentezini artıran ajanların yeni bir etki mekanizmasına işaret etmektedir.

In this study, we aimed to investigate possible relationship between Rho/Rho-kinase pathway and nitric oxide in rat coronary microvascular endothelial cells. Therefore, we cultured rat coronary microvascular endothelial cells. The effect of nitric oxide (NO) donors, glyceryl trinitrate (GTN, 10-7 M-10-8 M), sodium nitroprusside (SNP, 10-7 M-10-8 M), DETA-NO (10-5 M-10-6 M) and NaNO2 (10-3 M-10-4 M) and calcium ionophore A-23187 that induces NO synthesis and expression via increasing the intracellular calcium concentration, on the expression of ROCK enzyme (ROCK-1, ROCK-2) was investigated on basal as well as thrombin-stimulated conditions.Wistar rats were used in the study. Coronary microvascular endothelial cells were obtained by the mounted rat hearts on a constant-flow Langendorff system. The cell suspensions were plated and incubated at 37 oC under 5 % CO2. The third passage coronary microvascular endothelial cells was made quiscent 24 hours before experimentation and than NO donors, A-23187 or the Rho-kinase inhibitor, Y-27632 was incubated.After the incubation, the medium of flasks incubated with Y-27632 was taken and their nitrit-nitrate levels were measured by Griess method. The cells incubated with the other drugs was homogenized for measuring ROCK (ROCK-1, ROCK-2) enzyme expression levels by Western-Blotting technique.As a result, NO donors and A-23187 increasing NO synthesis, downregulated the expression of contractile protein Rho-kinase in the coronary microvascular endothelial cells. This finding indicates a new mechanism of action of NO donors and A-23187 that induces NO synthesis.