Hipoksik iskemik beyin hasarı oluşturulmuş yenidoğan sıçanlarda levetirasetam uygulamasının nöronal apopitozis ve motor yetiler üzerine etkilerinin değerlendirilmesi

Abstract

Perinatal dönemde oluşan hipoksik iskemik beyin hasarı (HİBH) yenidoğan bebeklerde zeka geriliği, görme ve işitme kaybı, motor kusurlar, epilepsi, beyin felci ve ölümün en önemli nedenlerindendir. Hipoksi-iskemi ve yeniden kanlanma sonrasında gelişen apoptozis şiddeti beyin hasarının bir göstergesidir. Hipoksi ve iskemiyi takiben yeniden kanlanma dönemine geçmeden önce verilecek tedaviler ile hasarı önlemek ya da azaltmak mümkün olabilir.Bu çalışmada, HİBH oluşturulan yenidoğan sıçan modelinde yeni kuşak antiepileptik bir ilaç olan levetirasetamın nöronal apopitozis üzerine etkisi erken dönemde histopatolojik ve biyokimyasal testlerle, geç dönemde ise davranış deneyleriyle araştırıldı.Çalışmaya 7 günlük yenidoğan sıçanlar rastgele alınarak dört gruba ayrıldı. Her bir gruptan 27 sıçan çalışmaya alındı. Grup 2, 3 ve 4'teki sıçanlara orta hat kesisi yapılarak sağ karotid arterleri bağlandı. Bu sıçanlar %8 oksijen içeren hipoksi odacığında iki saat bekletildi. Hipoksi sonrası Grup 2'dekilere serum fizyolojik, grup 3'tekilere levetirasetam (100 mg/kg) ve grup 4'tekilere levetirasetam (200 mg/kg) periton içi yolla (intraperitoneal, i.p) verildi. Grup 1'deki sıçanların ise karotid arterleri bulundu, fakat bağlanmadı. Bu sıçanlara hipoksi de uygulanmadı. Her gruptan 9 adet sıçandan hipoksi sonrası ikinci saatte kalp içi girişimle kan örneği alınarak malondialdehit, glutatyon peroksidaz, superoksit dismutaz ve katalaz enzim düzeylerine bakıldı. Kan örnekleri alındıktan sonra dekapite edilerek TUNEL ve Kaspaz-3 yöntemiyle apopitotik nöron sayısı değerlendirildi. Geriye kalan sıçanların geç dönemde lokomotor yetileri açık alan deneyi, öğrenme ve hafızaları ise morris su tankı testi ile değerlendirildi.TUNEL ve Kaspaz-3 yöntemi ile boyanan apopitotik hücre sayısının grup 2'deki sıçanlarda diğer gruptakilere göre anlamlı bir şekilde fazla olduğu saptandı (p<0.001). TUNEL yöntemiyle Levetirasetam 100 mg/kg ve 200 mg/kg uygulanan gruplarda, Kaspaz-3 yöntemiyle ise sadece levetirasetam 200 mg/kg uygulanan grupta apopitotik nöron sayısı serum fizyolojik uygulanan gruba göre anlamlı derecede daha azdı (p<0,001).Plazma malondialdehit düzeyi de grup 2'deki sıçanlarda daha yüksekti ve grup 1'deki sonuçlarla karşılaştırıldığında anlamlı fark saptandı (p=0,002). Plazma katalaz düzeyi grup 3'teki sıçanlarda daha yüksekti, ancak gruplar arasında anlamlı farklılık yoktu. Plazma glutatyon peroksidaz ve superoksit dismutaz grup 4'te grup 1, 2 ve 3'ten istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek bulundu.Doğumdan sonraki 10. haftada lokomotor aktivite açık alan deneyi ile değerlendirildi. Gruplar arasında hareket hızları ve katettikleri mesafeler yönünden farklılık yoktu.Morris su tankı testinde ise grupların ilk dört günde yükseltiyi bulma süreleri incelendiğinde tüm gruplar günler ilerledikçe bu süreyi anlamlı olarak düşürmekteydi. Yükseltiyi bulma süresi, 1. gün ile 4. gün arasındaki yükseltiyi bulma süresi farkı ve 5. gün yükseltinin olduğu doğu kadranında geçirilen süre bakımından sham grubu ile levetirasetam 200 mg/kg uygulanan grup 4 sıçanların sonuçları benzerdi. Bu gruplarla grup 2 ve 3 arasında ise istatistiksel olarak anlamlı fark vardı.On altıncı haftada dekapite edilen sıçanlarda en yüksek vücut ağırlığı grup 1'de, en düşük ise grup 3'te ölçüldü. En yüksek beyin ağırlığı ise ise grup 1 ve 4'teki sıçanlarda saptandı ve diğer 2 gruba göre anlamlı derecede daha yüksekti.Sonuç olarak bu çalışma ile levetirasetamın HİBH oluşturulmuş yenidoğan sıçanlarda erken dönemde apopitotik nöron sayısını azaltarak nöron koruyucu etkide bulunduğu histopatolojik olarak gösterilmiştir. Geç dönemde doz bağımlı olarak davranış deneylerine olumlu katkısının olduğu tespit edilmiştir. Sonuçlarımıza göre levetirasetamın nöron koruyucu etkinliğinin nedenlerinden birinin glutatyon peroksidaz ve superoksit dismutaz enzim düzeylerini arttırarak yaptığını düşünmekteyiz. Bu çalışma bizim bilgilerimize göre levetirasetamın HİBH oluşturulmuş yenidoğan sıçanlarda nöron koruyucu etkinliğini histopatolojik, biyokimyasal ve geç dönemde davranış deneyleriyle gösteren ilk çalışmadır.Anahtar kelimeler: Antioksidan enzimler, apopitozis, davranış deneyleri, hipoksik iskemik beyin hasarı, levetirasetam

Perinatal hypoxic ischemic brain injury (HIBI) is encountered one of the major causes of mental retardation, visual and auditory impairment, motor deficiencies, epilepsy, stroke and death in newborns. The severity of hypoxia-ischemia and increased number of the apoptotic neurons after reperfusion period are indicators of the brain injury. There is likelihood of preventing or minimizing the injury through the treatments to be administered prior to reperfusion, following hypoxia and ischemia.In this study, the effects of a new generation antiepileptic drug levetiracetam, on neuronal apoptosis by histopathological and biochemical tests in early period and experimentally in the long term behavior in neonatal rat model of HIBI were investigated.The 7 days-old neonatal rats included in the study were randomly divided into four groups. Twenty-seven rats from each group were studied. Midline incision was performed on the rats in Group 2, 3 and 4 and their right carotid arteries were ligated. These rats were kept in a hypoxia chamber containing 8% oxygen for two hours. After the hypoxia, normal saline was administered intraperitoneally to the rats in group 2, levetiracetam (100 mg/kg) to those in group 3 and levetiracetam (200 mg/kg) to those in group 4. The carotid arteries of those in group 1 were located, but not were ligated. The rats in this group were not exposed to hypoxia either. Blood samples were taken from 9 rats in each group two hours later than hypoxia and malondialdehyde, glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase enzyme levels were determined. After blood samples taken, those were capitated and the number of apoptotic neurons were evaluated by TUNEL and Caspase-3 methods. The long-term motor capabilities of remaining rats were evaluated through open field tests and learning and memories were evaluated through morris water tank test.The number of the apoptotic neurons dyed by TUNEL and Caspase-3 methods was observed to be significantly higher in group 2 compared to the other groups (p<0.001). The number of apoptotic neurons dyded by TUNEL was observed to be significantly lower in groups administered levetiracetam 100 mg/kg and 200 mg/kg and the number of apoptotic neurons dyded by Caspase-3 method was observed to be significantly lower in only levetiracetam 200 mg/kg group compared to saline group.Plasma malondialdehyde levels were also higher in group 2 rats and there was statistically significant difference compared to group 1 (p=0,002). Plasma catalase levels were higher in group 3 rats, but no statistically significant difference was identified in the comparision among the groups. Plasma glutathione peroxidase and superoxide dismutase levels were detected to be significantly higher in group 4 compared to group 1, 2 and 3.Locomotor activity was evaluated through open field tests at the 10th week of birth. The avarage speed activity and the distance they covered were not significantly different among the groups.In morris water tank test, in the first four days all groups significantly declined the period to find elevation as the days progressed. The findings of finding elevation time, the difference of finding elevation time in first and fourth days and time spent in the eastern quadrant in fifth day were similar between sham group and group 4. There were statisticaly significant difference compared to group 2 and group 3.In the rats decapitated in 16. week, the highest body weigth in group 1, the lowest body weight in group 3 were measured. Brain weight was highest in group 1 and 4 and there was statisticaly significant difference compared to other two groups.In conclusion, by this study in HIBI created neonatal rats, the levetiracetam?s neuroprotection efficacy by reducing the number of the apoptotic neurons in the early period is revealed histologically. In late period, positive contribution was found to be dose-dependent on behavioral tests. In this study, we think that levatiracetam shows a neuroprotective efficacy through increasing levels of glutathione peroxidase and superoxide dismutase. According to our knowledge, this is the first study showing the neuroprotection efficacy of levetiracetam in HIBI created newborn rats histopathological, biochemical and behavioral experiments on late periodKey words: Antioxidant enzymes, Apoptosis, behavioral experiments, hypoxic ischemic brain injury, levetiracetam.