Orak hücreli anemide NETosis

Abstract

AMAÇ:Orak hücreli anemide inflamasyon ve tromboz artmıştır. NETosis, birçokinflamatuar ve malign hastalıkta artmıştır ve trombozla ilişkilidir. Bu çalışmada, orakhücreli anemili hastalarda uyarılmamış nötrofillerde NETosis'in artıp artmadığınınaraştırılması amaçlanmıştır.MATERYAL VE METOT: Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji bölümünebaşvuran orak hücreli anemili hastaların ve sağlıklı kişilerin kan örnekleri, onamlarıalındıktan sonra alınmıştır. Çalışmaya, 25 (yirmibeş) orak hücreli anemi hastası vekontrol grubuna da 25 (yirmibeş) sağlıklı birey dahil edilmiş, hastaların ve sağlıklıbireylerin 2 mL'lik venöz kan örnekleri, nötrofil elastaz enzim düzeyi için EDTA'lı tüpe,Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı polikliniğinde alınmıştır. Nötrofilizolasyonu için EDTA'lı tüpe alınan kan örnekleri 4000 devirde 10 dakika santrifüjedildikten sonra +4 ºC'de Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, biyokimya laboratuarındasaklanmıştır. Tüm kan örnekleri aynı anda çalışılmıştır. MACSxpress® NeutrophilIsolatıon Kit Human kullanılarak elde edilen nötrofiller NETs oluşumu için kullanılmıştır.NETosis ASSAY Kit aşamasında hücreler NET assay buffer ile süspanse edilip inkübeedildikten sonra santrifüj edilerek nötrofil elastaz enzim aktivitesi çalışılması içintoplanmıştır. Elde edilen supernatantlara NET Assay Neutrophil Elastase Substrateeklenerek inkübe edildikten sonra plate üzerindeki film açılarak 405 nm deokutulmuştur. Standartlardan faydalanarak konsantrasyon absorbans grafiği çizilmişve hesaplamalar Tıbbi Farmakoloji Laboratuarında ve Biyokimya hesaplanmıştır.İmmun floresan ve taramalı elektron mikroskobu görüntüleri için hasta ve kontrolgruplarından kan örnekleri alınarak uygun protokollerle hazırlanmıştır.BULGULAR: Çalışmada; orak hücreli anemili hastalarda sağlıklı bireylere kıyaslaNETosis oluşumunun arttığı gösterilmiştir, bununla beraber her 2 grup arasındaistatistiki bir fark saptanmamıştır (p=0,329). Ağrılı kriz sayısının artmasıyla NETosisoluşumunun arttığı da gösterilmiştir.SONUÇ: Bu çalışmada, orak hücreli anemili hastalarda sağlıkla bireylere kıyaslaNETosis oluşumunun arttığı gösterilmiştir. NETosis oluşumun orak hücreli anemihastalığının etiyopatogenezine katkısına dair daha fazla sayıda vaka ile yapılmış dahafazla sayıda çalışmaya ihtiyaç vardır.

OBJECTIVE: The aim of this study was to demonstrate the increased inflammation insickle cell anemia by demonstrating the activity of NETosis and to regulate theprophylaxis necessary for life-threatening thrombosis, which may occur at the end ofthis process.MATERIAL AND METHODS:Blood samples of patients with sickle cell anemia andhealthy persons who applied to Mersin University Medical Faculty HematologyDepartment were taken after their consent was obtained. Twenty-five (25) and 25(twenty-five) healthy individuals were included in the study. 2 mL venous bloodsamples of the patients and healthy individuals, EDTA tube for neutrophil elastaseenzyme level, received at Mersin University Medical Faculty Hematology Department.Blood samples taken into EDTA tube for neutrophil isolation were centrifuged at 4000rpm for 10 minutes and stored at +4 ºC at Mersin University Medical Facultybiochemistry laboratory. All blood samples were studied simultaneously. Neutrophilsobtained using MACSxpress® Neutrophil Isolation Kit Human were used for NETsformation. In the NETosis ASSAY Kit stage, cells were suspended with NET assaybuffer and incubated, then centrifuged to collect neutrophil elastase enzymeactivity.The supernatants were incubated with the addition of NET Assay NeutrophilElastase Substrate and the film on the plate was opened at 405 nm. The concentrationabsorbance graph was drawn by utilizing the standards and the calculations werecalculated in the Medical Pharmacology Laboratory and Biochemistry.Blood samples from patient and control groups were prepared for appropriatefluorescence and scanning electron microscope images and prepared with appropriateprotocols.RESULTS: Although no statistically significant difference was found, we showed thatNETosis formation increases in patients with sickle cell anemia compared to healthysubjects (p=0,329). We also showed that NETosis formation increses with theincreasing number of painfull crisis in these patients.CONCLUSION:In this study, it has been shown that NETosis formation increases in patients with sicklecell anemia compared to individuals with health subjects. However, more studies withlarger number of cases are needed for understnading the NETosis in theethiopathogenesis of sickle cell disease.