Yağdan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin yağ hücrelerine diferansiyasyonu ve proliferasyonu üzerine kitosan doku iskelesinin etkisi

Abstract

Yağdan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin Yağ Hücrelerine Diferansiyasyonu ve Proliferasyonu Üzerine Kitosan Doku İskelesinin EtkisiKök hücreler, farklı hücre tiplerine dönüşme potansiyeline sahip olup, çoğalarak yeni kök hücreler ve olgun işlevsel hücrelere diferansiye olabilmektedirler. Ancak çoğunlukla istenilen hedef doku hücre diferansiyasyonu sağlamakta zorluk yaşanmakta, verildiği bölgede kök hücreler ya farklı doku kompartmanlarına geçebilmekte, ya işlevsiz kalmakta ya da ölerek ortadan kaldırılmaktadır. Çalışmamız, kök hücreleri bir iskele üzerine yerleştirerek istenilen doku formatına diferansiyasyonunu sağlamak ve hücrelerin farklı doku kompartmanlarına geçmesini engellemek amacı ile yapıldı. Deney hayvanlarının inguinal bölgelerinden anestezi altında yaklaşık 1 cm³ yağ greftleri alınarak,steril tuzlu fosfat tamponu (PBS) ile yıkandıktan sonra steril bir bistüriyle küçük parçalara (yaklaşık 1 mm³) bölündü. Bu parçalar %0.075 konsantrasyonda Tip 1 kollajenaz içeren medyumda 37 °C sıcaklıkta 30 dakika bekletilerek enzimatik parçalanma gerçekleştirildi. Daha sonra bu süspansiyon 70 μm'lik steril hücre filtresinden geçirilerek büyük debrislerden arındırıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu 200 g hızında 10 dakika santrifüj edildikten sonra pellet steril PBS ile resüspande edilerek yıkandı ve tekrar aynı hız ve sürede santrifüjden sonra %20 fötal sığır serumu (FBS), %1 penisilin-streptomisin ve %1 amfoterisin içeren DMEM medyumunda resüspande edildi. Hücreler Thoma™ lamı ile sayıldıktan sonra cm² başına 3×105 hücre olacak şekilde uygun petri kaplarına ekildi. Hücreler konfluense ulaştıktan sonra tripsin-EDTA solüsyonu ile kaldırıldı ve sonra pasajlanarak çoğaltıldı. Hücreler yeterli sayıya ulaştıklarında steril edilmiş kitosan parçacıklar üzerine ekildi ve tutunmalarını takiben defekt onarımı için kullanıldı. Kültüre edilen kök hücrelerin medyumunda sürekli olarak 10 mM konsantrasyonda timidin analoğu BrdU bulundurularak mitozla bölünen hücrelerin işaretlenmesi sağlandı. Tavşanlar sadece kök hücre verilen, üzerine kök hücre ekilmiş kitosan verilen ve sadece kitosan verilen olmak üzere 3 gruba ayrıldı (n=8). Hazırlanan süspansiyonlar, anestezi altında hayvanların sağ maksiller bölgesine enjekte edildi. Sol maksiller bölgeleri ise kontrol olarak kullanıldı. Sağ maksiller bölgede cilt üzerinde şişlik oluşan bölgelerin kılları tıraşlanarak, verilen bölgeler işaretlendi. Tavşanlar 3 hafta kafes ortamında standart koşullarda takip edildi. Sonrasında 18 tavşandan bilgisayarlı tomografi yardımı ile görüntüler elde edildi. Elde edilen görüntüler yardımı ile volümetrik inceleme yapıldı. Anestezi altında tavşanların tıraşlanan cilt bölgeleri periost üzerinden eksize edildi. Daha sonra tavşanlar yüksek dozda anestezi ile sakrifiye edildi. Alınan doku örnekleri immün işaretleme ile ve histopatolojik olarak değerlendirildi. Verilen mezenkimal kök hücrelerin yağ hücrelerine diferansiyasyonu ve proliferasyonu değerlendirilerek kitosan iskelesinin etkileri kıyaslandı. Mezenkimal kök hücreler, birçok hastalık tedavisinde kitosan doku iskelesi sayesinde kullanılabilir. Hastalıkların morbidite ve mortalitesini azaltarak ekonomik açıdan da maliyetlerde ciddi azalmalar sağlayabilir.

The Effect of Chitosan Tissue Scaffold on Differentiation and Proliferation of Mesenchymal Stem Cells Obtained from Fat Stem cells are puliripotent and differentiated into various cells in the body. However, it is difficult to achieve the desired target tissue cell differentiation, and the stem cells can be transferred to different tissue compartments. Our study is carried out with the aim of placing the stem cells on a scaffold to provide differentiation to the desired tissue format and to prevent their cells from passing into different tissue compartments. Approximately 1 cm³ of fat grafts will be taken from the inguinal regions of the experimental animals under anesthesia. The fat grafts taken will be washed with sterile saline phosphate buffer (PBS) and then divided into small pieces (approximately 1 mm³) with a sterile scalpel. These fractions will be kept in a %0.075 concentration of type I collagenase medium at 37 ° C for 30 minutes and enzymatic degradation will be carried out. This suspension is then passed through a 70 μm sterile cell filter to remove large debris. The resulting cell suspension was centrifuged at 200 g for 10 minutes and resuspended with sterile PBS. Once the cells are counted with a Thoma ™ slide, they will be planted in suitable petri dishes that will have 3 × 105 cells per cm 2. After the cells are confluent, they will be replicated by trypsin-EDTA solution. Once the cells have reached a sufficient number, they will be sown on sterile chitosan particles and will be used for defect repair following attachment. In the medium of the cultured stem cells, the thymidine analogue BrdU will be continuously present at a concentration of 10 mM. Cells will internalize this substance at each cleavage by adding to the genomes and cells will be marked histochemically. Stem cells; one million for the experimental group with scaffold chitosan to be made into a solution of 1cc, another million with 1cc isotonic is used for the other group. 18 rabbits will be divided into three groups. The left maxillary region will be the control group in the right maxillary region of the first group under anesthesia. the left maxillary region will be the control group to give chitosan, which is the only tissue scaffold to the right maxillary region of the second group. Chitosan and stem cells will be given to the right maxillary region of the third group and left maxillary region will be the control group. In the right maxillary region, the areas of the skin that have swelling on the skin will be trimmed and the regions indicated will be marked. 3 weeks rabbits will be followed under natural conditions in cage environment. After 18 rabbits, images will be obtained with the help of computer tomography. Volumetric analysis will be performed with the help of the obtained images. The skin areas of the rabbits under anesthesia will be excised through the periosteum. They will be divided into experimental and control groups. Rabbits will be sacrificed with high doses of anesthesia. Tissue samples taken will be evaluated histopathologically. The differentiation and proliferation of mesenchymal stem cells to fat cells will be evaluated and the effects of chitosan scaffold will be compared. Mesenchymal stem cells will be used for the treatment of many diseases thanks to the chitosan tissue scaffold. There will be significant reductions in the costs of the diseases, which will reduce the morbidity and mortality of the diseases.