Cytotoxicity of peroxynitrite and nitric oxide induced oxidative stress on 3T3 fibroblast cell line

Abstract

ÖZET Bu çalışmada biyolojik olarak önem taşıyan iki molekül; NO ve ONOO` 'nun 3T3 fibroblast hücreleri üzerindeki oksidasyon ve toksik özellikleri incelenmiştir. NO pek çok fizyolojik olayda anahtar görevi taşimasinin yaninda, reaktif olmasi sebebiyle pek çok hücre ve dokuya zarar vermektedir. NO kisa bir surede O2 '` ile reaksiyona girerek çok kuvvetli bir oksidan olan ONOO`' yu oluşturur. Hücre morfolojisi ve canliliği ile ilgili bulgular NO ve ONOO'nun 3T3 Fibroblast hücrelerine büyük oranda zarar verdiğini göstermiştir. Hücre içindeki reaktif oksijen türleri (ROT)'nin oluşumunu tesbit için DCFH-DA floresan boyasi kullanilmiştir. Hücreler NO ile inkübe edildiğinde floresan ışığın yoğunluğunun kontrole göre önemli miktarda arttığı saptanmıştır ve bu bulgu florometrik analizlerle de desteklenmiştir. Benzer sonuçlar hücrelerin aynı konsantrasyon aralığında ONOO` ile inkübasyonuyla da elde edilmiştir. Bulguları genişletmek amacıyla apoptotik hücrelerin görüntülenmesini sağlayan floresan boya Hoechst 33342 (HO) kullanılmış ve hem NO hem de ONOO'nun apoptozize sebep olduğu saptanmıştır. Molekuler çalışmalarda, hücreler oksidan moleküller NO ve ONOO` ile değişik zaman aralıklarında ve benzer dozlarda inkube edilmiştir. Turn şartlarda, DNA 'nın parçalanmadan kalmış olması NO ve ONOO` 'nun yol açtığı sitotoksik etkinin apoptozizden başka bir mekanizmaya dayandiğini göstermektedir. Bu olay daha ileri mekanistik çalışmaları gerektirmektedir. Potansiyel bir antioksidan molekül olan Catechin sitotoksiteye karşi koruyucu molekül olarak çalışılmıştır. Kimyasal model sistemde Catechin ONOO` ile reaksiyona sokulmuş ve elde edilen ürünün FT-IR ve NMR analizleri bize ürünün yapısı hakkında ön bilgi vermiştir. Hücre çalışmalarında, Catechin' nin NO ve ONOO` 'nin yol açtığı sitotoksite üzerindeki etkisi incelenmiştir. Catechin' nin koruyucu etkisini sağlayan optimum koşullar 5 (LiM Catechin, 50 yM NO ve 200 uM ONOO` içindir. Elde edilen bulgular, ROT'un yol açtığı sitotoksitenin sinyal iletisi mekanizmalari ışığında değerlendirilmiştir. VII

ABSTRACT In the present study, the oxidative and cytotoxic effects of two biologically important molecules, NO and ONOO` have been studied in 3T3 Fibroblast cell line. NO is a key molecule in many physiological pathways, but also its reactivity gives it the potential to cause considerable damage to cells and tissues. NO reacts rapidly with superoxide anion (O2 '`) to form ONOO` which is a powerful oxidant. Cell morphology and viability studies showed that both NO and ONOO` caused significant loss of viability in 3T3 fibroblast cell line. Intracellular ROS production has been monitored by a fluorescent probe, DCFH-DA. When cells were treated with of NO, a significant increase in fluorescence intensity has been observed when compared to the control cells and this was supported with flourometric analysis results. Similar results have been observed when cells were incubated with ONOO` at the same concentration range. To further studies, cells were stained by a fluorescent probe Hoechst 33342 (HO) to identify apoptotic cells; both NO and ONOO` induced apoptosis. In molecular studies, cells were incubated with the oxidant molecules, NO and ONOO` for different time periods and at all relevant doses. In all conditions, DNA remained intact; indicating that cytotoxic effect of NO and ONOO` were merely due to a mechanism other than apoptosis. This phenomena requires further mechanistic studies. A potential antioxidant molecule, Catechin has been studied as a preventive molecule against cytotoxicity. In chemical model system Catechin was left to react with ONOO` and FT-IR and NMR analysis of the end product gave us preliminary information about its structure. In cellular studies, the effect of Catechin on NO and ONOO` induced cytotoxicity was investigated. The optimum determined conditions for preventive effect of Catechin were 5 uM of Catechin for 50 uM of NO and 200 uM of ONOO`. These results were discussed in the light of ROS induced cytotoxicity in cellular signaling mechanisms. VI