Refolding kinetics of lysozyme: Nuclear magnetic resonance and molecular dynamics study of hen egg-white lysozyme

Abstract

L ZOZOMUN TEKRAR KATLANMA K NET :TAVUK BEYAZI L ZOZOMUNUN NÜKLEER MANYET KREZONANS VE MOLEKÜLER D NAM K ÇALI MASIÇET N BALO LUÖZET300-355 K dereceleri içerisinde gerçekle tirilen NMR grafik analizi ve molekülerdinamik (MD) simülasyonları , tavuk yumurtası beyazı lizozomu proteininin katlanma,bozulma ve jelle mesini inceleme amaçlı kullanıldı. lk olarak H1 deneyleri referans amaçlı 5mikrolitre asetonitril eklenen 10%D2O / 90%H2O çözeltisi ile hazırlanmı proteinörneklerinde gerçekle tirildi. Örnekler NMR algılayıcısı içerisine yerle tirilen örne insıcaklı ının artırılıp azaltılması ile bozulum ve katlanmaları sa lanarak, gerçek zamanlıyapısal de i ikliklere i aret eden tek boyutlu grafikler elde edildi. NMR deneyleri aynızamanda yüzeyi 13C-metil grupları ile zenginle tirilmi lizozom ile de gerçekle tirildi. Bununyanında lizozomun ısısal kaynaklı jelle mesi farklı miktarlardaki B1 vitamini ortamı modelalınarak incelendi. Bir enzim kofaktörü olan vitamin B1'le etkile ime giren protein, yükselensıcaklı a kar ı yüksek bir direnç kazandı. Protein yapısındaki, sıcaklık nedeniyle olu anyapısal de i iklikleri karakterize etmek ve protein ile yapılan çalı maların yönünü belirlemekamaçlı MD çalı maları gerçekle tirildi. Lizozomun çatısal yapısı, ısı kapasitesi, suyla temaseden yüzey analizi ve çözelti da ılım fonksiyonları 300-355K derecelerinde 2ns, 500Kderecesinde 4ns süren simülasyonlarla incelendi. Isı kapasitesi ile elde edilen sonuçlarınönceki çalı malarla uyum içinde oldu u; NMR deneyleri ile de gösterilen, bozuluma dirençnoktaları ve bozulum derecelerini gösterdi i görüldü.Genel olarak elde etti imiz sonuçlardan proteinlerin bozulum a amasında arayapılardan kaynaklanan ve deneysel yollarla beraber moleküler dinamik simülasyonları ile degörülebilecek özel bir iz ta ıdı ı sonucuna varıldı.

REFOLDING KINETICS OF LYSOZYME:NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE & MOLECULAR DYNAMICSSTUDY OF HEN EGG-WHITE LYSOZYMEÇET N BALO LUABSTRACTNMR spectral analyses and molecular dynamics (MD) simulations in the temperaturerange of 300-355K and at 500K were used to probe the unfolding, refolding and gelation ofnative hen egg-white lysozyme. In the first part, preliminary 1H experiments were conductedon samples that had been freshly dissolved in 10%D2O / 90%H2O and spiked withacetonitrile as reference. The samples were encouraged to unfold and refold by ramping thetemperature of the NMR probe, yielding real-time spectra that reflected changes of structure.NMR experiments were also performed on lysozyme that had been labeled along the surfacewith isotopically enriched 13C-methyl groups. Furthermore, the thermal gelation of egg-whitelysozyme was monitored in solution containing different amounts of vitamin B1 as modelincipient. Protein incubated with moderate amounts of vitamin B1, an established enzymecofactor, showed higher tolerance to the denaturing effects of elevated temperature. Incomparison, MD simulations were used to characterize the global changes of protein structureupon thermal treatment and served as a knowledge base to carry out subsequent NMRbackbone dynamics studies. The backbone dynamics of lysozyme were assessed using 2nsMD simulations between 300K 355K and 4ns for 500K, in which C-alpha fluctuation vector,relaxation times, heat capacity, accessible surface area and solution scattering functions werecompared against related experimental findings.In general, the results supported previous interpretations that a protein fingerprintexists, which make out distinct intermediates forming along the unfolding pathways.