Screening of plant factors that modulate the activation of the NF-kB transcription factor in mammalian cells

Abstract

NF-kB aktivasyonuna yol açan sinyal iletim yolu, bağışıklık sistemindeki önemi sebebiyle geniş ölçüde çalışılmaktadır. Bu iletim yolundaki moleküller bağışıklık sistemini harekete geçirme ya da baskılamadaki rolleri nedeniyle insan hastalıklarını tedavi açısından da önemlidirler. NF-kB sinyal iletim yoluyla etkişebilecek bitki proteinlerini bulmak amacıyla bir genetik tarama düzeneği hazırladık. Tarama düzeneğimiz memeli hücre kültüründe ifade edilmiş ankyrin tekrarları içeren bitki proteinleriyle birlikte NF-kB aktivasyonuna bağlı olarak yeşil florasan protein (GFP) ifade eden NF-kB raportör vektöründen meydana geldi. Doku kültürü sistemi olarak kolay transfekte edilebilen insan embryonik böbrek hücresi HEK293T hücrelerini kullandık. Taramayı gerçekleştirmek için, temel moleküler biyoloji klonlama teknikleri kullanarak NF-kB aktivasyonuna duyarlı bir GFP raportör plazmidi inşaa ettik ve The Arabidopsis Information Resource'dan (TAIR) temin ettiğimiz plasmidleri kullarak Cre-enzimi rekombinasyon reaksiyonları ile 90 adet A. thaliana DNAsından oluşan bir memeli ifade vektörü kütüphanesi hazırladık. Bitki ankyrin tekrarlı proteinlerine odaklanmamızın üç nedeni vardır. Öncelikle, memeli ankyrin-tekrarlı proteinlerinin direkt olarak NF-KB'ye bağlandığı gösterilmiştir. İkincil olarak, değişik genomlar tarafından kodlanan proteinlerin birbiriyle etkileşme olasılığı yüksektir, ve son olarak da A. thaliana ankyrin-tekrarlı proteinleri bitki bağışıklık sisteminde rol oynamaktadırlar. Bu nedenlerden dolayı taramalarımızı 90 adet ankyrin-repeat A. thaliana proteiniyle sınırladık. Bu tarama sonucunda memeli hücrelerde ifade edilmiş 90 bitki cDNAsından üçünün raportör vektörümüzün GFP ifade miktarını değiştirerek, TNF-ot'ya bağlı NF-kB aktivasyonunu etkilediğini bulduk.

The signal transduction pathway that leads to the activation of NF-kB İs extensively studied because of its importance in immune system activation. Any molecule that interferes with the pathway is therapeutically important because of its potential role in triggering or inhibiting the immune response. To identify proteins that interfere with the activation of NF-kB, we designed and performed a genetic screening system of plant proteins. ur screen consisted of ankyrin repeat plant proteins expressed in mammalian tissue culture cells along with an NF-kB reporter vector that expressed Green Fluorescent Protein (GFP) upon NF-kB activation. As a tissue culture system we used the easily transfected human embryonic kidney celi line HEK293T. To perform our screen, we generated an NF-kB sensitive GFP reporter plasmid by Standard molecular biology cloning techniques and we constructed a library of mammalian expression vectors that contained 90 A. thaliana cDNAs by Cre-mediated recombination between plasmids. We restricted our analysis to 90 cDNAs of ankyrin repeat domain containing proteins from A. thaliana for three reasons: First, ankyrin repeat containing proteins encoded by the mammalian genome have been shown to directly bind to NF-kB, second, proteins encoded by different genomes have the potential to interact with higher affınity than those encoded by the same genome and fınally, some A. thaliana ankyrin repeat domain proteins have been shown to be involved in plant immune responses. in our screen we found out that three out of 90 plant cDNAs that were expressed in mammalian cells affected TNF-ot induced NF-kB activation by changing GFP expression from our reporter vector.