Pramanicin-A induces apoptosis in HCT116 colon carcinoma cells: Activation of JNK, p38, ERK and induction of oxidative stress

Abstract

Pramanicin yeni bulunan bir anti-fungal ajandır. Bu çalışmada, HCT116 kolon kanseri hücrelerinde, sekiz analoğun MTT proliferasyon yöntemi kullanılarak sitotoksik potansiyelleri taranmıştır. PMC-A (25uM) ve PMC-F (75uM), bu analoglar içerisinde en güçlü potansiyele sahip ajanlar olanlar olarak bulunmuştur. Flowsitometrik ve M30 apoptosense eliza yöntemine dayanarak elde edilen sonuçlar PMC-A' nın PMC-F' e gore daha güçlü bir apoptotic ajan olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sebeple çalışmanın tümünde PMC-A kullanılmıştır. Bununla birlikte bax ve puma knock-out hücreler ile yapılan çalışmalarda, sitotoksisite bakımından anlamlı bir fark bulunamamış ve çalışmanın tamamında normal tip HCT116 hücreleri kullanılmıştır. Daha ileriki aşamada PMC-A' nın apoptotic etkisinin moleküler düzeyde araştırılması için, MAPK yolakları spesifik antikor ve inhibitorler kullanılarak araştırılmıştır. Yapılan immunoblot çalışmalarında PMC-A' nın JNK, p38 ve ERK1/2 üzerinde farklı zaman kinetiklerine uygun olarak aktive edici etkisinin olduğu ortaya çıkarılmıştır. Kaspaz-3 ve Kaspaz-9' un spesifik inhibitorler ile baskılanması apoptozu başarılı bir biçimde durdururken, tam ters bir etki ile JNK ve p38 aktivasyonlarının inhibisyonları apoptozu potansiyelize ederek daha fazla hücrenin ölmesine yol açmıştır. Bu sonuçlar göstermektedir ki, PMC-A kaynaklı apoptoz Kaspaz yolaklarına bağlı iken, JNK ve p38' in içerisinde bulundukları yolaklar hücrenin yaşaması ile ilişkili yolaklar ile ilişkili olabilir. Bununla birlikte ERK1/2' nin inhibisyonu ne apoptoz nede sağ kalım üzerinde herhangi bir etki oluşturmamaktadır. Son olarak, çalışmamızda florometrik ve flowsitometrik D2CDF-DA boyama yöntemi kullanılarak yapılan çalışmalarda, PMC-A'nın MAPK yolakları gibi birçok yolağı aktive edebilen veya kendi başına bir ikincil haberci gibi davranarak apoptoz oluşumunda rol alabilen reaktif oksijen ürünlerinin oluşumuna aracılık ettiği hem erken (1saat, 2saat) hemde geç zaman (24saat) dilimlerinde ortaya konulmaktadır.

Pramanicin (PMC) is a novel anti-fungal agent. In this study, among eight analogues screened by MTT cell proliferation assay for their potential cytotoxic effect on HCT116 colon cancer cells, Pramanicin-A and Pramanicin-F were found to be the most effective candidates at the concentration of 25uM and 75uM respectively. Flow-cytometric analyses with Annexin-V staining and M30 apoptosense eliza assay confirmed that PMC-A is a more effective apoptotic agent compared to PMC-F, thus PMC-A was selected for further studies. Moreover, no difference in cytotoxicity was observerved in puma and bax defficient cell lines, therefore further studies were conducted with HCT116 wild type cells. In order to get insight into the mechanism of apoptotic response by PMC-A, we followed MAP kinase pathways with using specific MAPK antibodies and inhibitors. Our immunoblotting data reveals that PMC-A induced the activation/phosphorilation of c-jun terminal kinase (JNK), p38 and extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) in different time kinetics. Inhibition of caspase-3, and caspase-9 with their specific inhibitors prevent apoptosis. Interestingly inhibition of JNK and p38 activations/phosphorilations potentiated the apoptotic response. These data indicate that PMC-A induced apoptosis is mediated by caspase dependent pathways, activation of JNK and p38 but not ERK 1/2 may have a pro-survival role.Finally our data from flow-cytometric and flourometric analyses with D2CDF-DA staining revealed induction of reactive oxygen species (ROS) acting as second messengers which may activate MAPK signaling pathways as well as other signaling pathways in apoptotic response of cells to PMC-A at early (1h, 2h) and late (24h) time points.