Cloning, expression and purification of Durum wheat metallothionein domains and structural modelling

Abstract

Metallothioneins (MTs) are small proteins with high cysteine content and high binding capacity for metals including Zn, Cu and Cd. They exist in a wide range of organisms and are classified in one super-family according to the distribution of cysteine motifs in their sequences. Type I plant MTs, similar to mammalian MTs, have the cysteine motifs clustered in the N-and C-termini constituting the ß- and ?-domains, respectively. In type I plant MTs the two domains are connected by a long (about 42 amino acids) hinge region whose structural and functional properties are unclear.A mt gene in Cd resistant durum wheat coding for a type I MT (dMT) was identified and the recombinant protein (dMT) was overexpressed in E. coli as GST fusion (GSTdMT) (Bilecen et al., 2005). In the present study, for detailed structural investigations; GST-fusion constructs of ß-hinge, ?-hinge and the isolated hinge domains of dMT were overexpressed in E. coli. Proteins were purified and were characterized by size exclusion chromatography, SDS- and native-PAGE, limited trypsinolysis, inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES), UV-vis absorption spectroscopy, dynamic light scattering (DLS) and small-angle solution X-ray scattering (SAXS).GSTdMT fusion constructs were purified as stable dimeric forms in solution. Cd2+/protein ratio were found to be 1.53 ± 0.6 for GSTß-hingedMT and 1.5 ±0.8 for GST?-hingedMT. GSThingedMT and GST?-hingedMT were easily cleaved from the hinge region confirming its susceptibility to proteolytic attack. Hinge region in the GSTß-hingedMT construct, on the other hand, was protected. Cleavage was not observed in the constructs within the ß- and ?-domains which strongly indicated their compact structure with the bound Cd2+ ions.SAXS measurement results indicated that GSThingedMT, GSTß-hingedMT and GST?-hingedMT have symmetric, elongated shapes. ab initio models revealed structures with GST molecules forming electron dense regions at the center of mass and the partner dMT domains extending from this region. Evidence from Cd-binding, tryptic cleavage and SAXS models suggest that hingedMT, ß-hingedMT and ?-hingedMT structures fold independently of GST in the fusion constructs. The combination of SAXS results with biochemical data indicated extended structures for the dMT domains and supports the dumbbell model previously proposed for durum wheat MT (Bilecen et al., 2005).

Metallotioninler (MT?ler), küçük molekül ağırlıklı, sistince zengin, Zn, Cu ve Cd gibi metallere yüksek bağlanma kapasitesi olan proteinlerdir. MT?ler hemen hemen bütün organizmalarda bulunurlar ve amino acid dizilimlerindeki sistin motiflerinin dağılımına göre tek bir süper familya içerisinde sınıflandırılırlar. Tip I bitki MT?leri, memeli MT?lerine benzer bir şekilde, N- ve C- uçlarında sistin motifleri içerirler ve bu bölgeler ß- ve ?- bölgeleri olarak adlandırılır. Tip I bitki MT?lerinde, ß- ve ?- bölgeleri uzun (yaklaşık 42 amino asit) bir köprü bölgesi ile bağlanırlar. Köprü bölgesinin yapısal ve işlevsel özellikleri henüz açıklık kazanmamıştır.Cd?a dirençli durum buğdayında Tip I bitki MT geni tesbit edilmiş ve E.coli bakterisinde GST füzyon proteini (GSTdMT) şeklinde sentezlettirilmiştir (Bilecen, 2005). Bu tezdeki çalışmada, detaylı yapısal ve işlevsel incelemeler yapmak amacıyla, dMT?nin ß- köprü, ?-köprü ve köprü bölgeleri ayrı ayrı GST füzyon proteini olarak E.coli?de sentezlettirilmiştir. Proteinler saflaştrılmış ve özellikleri moleküler elek kromotografisi (SEC), SDS ve natif PAGE, tiripsin ile limitli kırılma, UV-vis absorbsiyon spektrofotometresi, ICP-OES spektrofotometresi, dinamik ışık saçılması (DLS) ve X-ışınları küçük açı saçılma (SAXS) yöntemleri kullanılarak incelenmiştir.Proteinler çözeltide dimer halinde bulunmaktadır. Cd2+ bağlanma oranı GSTß-hingedMT için 1.53 ± 0.6 ve GST?-hingedMT için 1.5 ±0.8 olarak hesaplanmıştır. Tiripsin ile kırılma çalışmaları GSTköprüdMT ve GST?-köprüdMT proteinlerinin köprü bölgesinden kesildiğini göstermiştir. Bu durum köprü bölgesinin proteolitik hücumlara hassas olduğunu kanıtlamaktadır. GSTß-köprüdMT and GST?-köprüdMT proteinlerinde tiripsinle kırılma ß- ve ?- bölgeleri içinde görülmemektedir ki bu da bu bölgerin bağladıkları Cd2+ ile katlanarak kapalı bir yapıya sahip olduklarını göstermektedir. .SAXS ölçümleri GSTköprüdMT, GSTß-köprüdMT ve GST?-köprüdMT?nin uzun simetrik şekle sahip olduklarını göstermiştir. ab initio modelleri merkezde GST dimerinin oluşturduğu bir elektron yoğun bölge ve bu bölgeden iki ayrı yönde uzanan köprüdMT, ß-köprüdMT ve ?-köprüdMT moleküllerinden oluşan bir yapı göstermektedir. Cd bağlama özellikleri, tiriptik kırılma analizi sonuçları ve SAXS sonuçları köprüdMT, ß-köprüdMT ve ?-köprüdMT yapılarının GST?den bağımsız oluştuğuna işaret etmektedir. SAXS sonuçları ve biyokimya verileri dMT bölgeleri için uzun bir yapı vermekte ve sonuçlar dMT yapısının daha önce önerilen (Bilecen, 2005) halter benzeri bir şekle sahip olduğunu desteklemektedir.