Identification of the interacting protein partners of the ThPOK transcription factor

Abstract

T hücreleri kazanılmış bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır. T lenfositlerin gelişiminde önemli aşamalardan biri T hücrelerinin CD4 veya CD8 tekli pozitif hücreler olarak kökenleşmesidir. Bu kökenleşmenin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların belirlenmesi uzun süredir önemli bir araştırma konusu olmuştur.ThPOK (Yardımcı T hücrelerini uyaran POZ/Krüppel-benzeri faktör), homodimerizasyon ve diğer proteinler ile olan etkileşimde rol oynayan BTP/POZ ve Krüppel-benzeri zinc finger bölgelerine sahiptir. Timositlerin gelişimi sırasında ThPOK proteini N-terminal BTB/POZ bölgesi aracılığıyla, MHC-II kısıtlı timositlerin CD4 tekli pozitif hücrelere dönüşmesinde aracı olmaktadır. Bu çalışmada geleneksel ?maya ikili hibrit? sistemini kullanarak, insan timus cDNA kütüphanesini ThPOK proteininin BTB/POZ bölgesine karşı taradık ve bu protein ile etkileşim içindeki proteinleri belirlemeyi amaçladık. DNA sekanslanması ve BLAST analizi sonucunda, etkileşim gösteren proteinleri belirledik. Belirlenen etkileşimleri ikincil ?maya ikili hibrit? taraması aracılığıyla yeniden doğruladık. Belirlenen proteinlerin aktarıldığı memeli hücrelerinde immün çökeltme deneyleri yaparak, varolan etkileşimleri biyolojik olarak ilişkilendirdik. Çalışma sonucunda bu proteinlerden POMP, MEF2B, TCF7, ZNF384, DPP7, HINT2 ve PARP12 olmak uzere yedi tanesinin, ThPOK proteinin BTB/POZ bölgesiyle etkileşime girdiğini gösterdik.

T lymphocytes are an essential part of the adaptive immune system. In the course of T lymphocyte development, one crucial step is the decision to commit to one of two lineages: CD4 and CD8 single positive (SP) T cells. The cellular and molecular mechanisms underlying T cell lineage commitment has long been the subject of intense debate.ThPOK, T-helper-inducing POZ/Krüppel like factor, is a zinc finger transcription factor containing both a Krüppel-like zinc finger domain and a BTP/POZ domain, which has been linked to homodimerization and recruitment of other proteins. During the development of thymocytes, the ThPOK protein mediates the differentiation of MHC-II restricted thymocytes into the CD4 SP lineage, using its N-terminal BTB/POZ domain. We screened a human thymic cDNA library against the BTB/POZ domain of the ThPOK protein to identify its interacting protein partners by using a conventional yeast two hybrid system. We identified putative interacting proteins by performing DNA sequencing and bioinformatics analysis on relevant prey protein encoding plasmids. We re-confirmed these interactions in yeast cells by secondary yeast two hybrid screens. We confirmed the biological relevance of the identified interactions by performing co-immunoprecipitation experiments in transfected mammalian tissue culture cells. We demonstrated that seven proteins, named POMP, MEF2B, TCF7, ZNF384, DPP7, HINT2 and PARP12 can interact with the BTB/POZ domain of the ThPOK protein.