Effect of reactive oxygen species in cisplatin-induced apoptotic response of HCT 116 colon carcinoma cells

Abstract

Bu çalışmada öncelikle, hücrelerin sisplatin uygulamasına canlılık açısından tepkisi incelendi. Hücre canlılığını göstermek için, MTT Analizi bir antioksidan olan asetilsisteinin (NAC) ön-uygulaması yapılarak ve yapılmadan kullanıldı. MTT Analizi 30µM sisplatin NAC olmadan 24h uygulandığında hücre canlılığında wt için yaklaşık %19 ve p53-/- için yaklaşık %21 azalma gösterdi. 30µM sisplatin NAC olmadan 48h uygulandığında ise, hücre canlılığında wt için yaklaşık %72 ve p53-/- için yaklaşık %31 azalma gösterdi ancak NAC verildiğinde wt için 20% artış gözlendi. Sisplatine bağlı apoptotik tepkinin boyutlarını NAC ön-uygulamasının yapıldığı ve yapılmadığı durumlarda görüntülemek için Annexin-V işaretlemesi kullanılarak Akış Sitometrisi kullanıldı. Akış Sitometrisi 30µM sisplatin NAC olmadan 24h uygulandığında apoptotik tepkide wt için yaklaşık 1.6 kat ve p53-/- için yaklaşık 2.4 kat artış gösterdi fakat NAC verildiğinde wt için 20% azalış gözlendi. 30µM sisplatin NAC olmadan 48h uygulandığında ise, apoptotik tepkide wt için yaklaşık 4.7 kat ve p53-/- için yaklaşık 2.6 kat artış gösterdi fakat NAC verildiğinde wt için 57% azalış gözlendi. Elde edilen data wt ve p53-/- hücrelerinin yaşayabilirlikte sisplatin dozu ve antioksidan ön-uygulamasına bağlı olarak değişiklik gösterdiğini bildirdi. Bu da apoptotik tepkinin bir kısmının yükselen ROT seviyeleriyle ilintili olduğunu işaret etti.Ek olarak, Akış Sitometrisinde ROT için işaretleyici olarak DCFH-DA kullanıldı. Akış Sitometrisi 30µM sisplatin NAC olmadan 24h uygulandığında apoptotik tepkide wt için yaklaşık 4 kat ve p53-/- için yaklaşık 3.2 kat artış gösterdi fakat NAC verildiğinde wt için 50% azalış gözlendi. 30µM sisplatin NAC olmadan 48h uygulandığında ise, apoptotik tepkide wt için yaklaşık 5.2 kat ve p53-/- için yaklaşık 5 kat artış gösterdi fakat NAC verildiğinde p53-/- için 66% azalış gözlendi. İkinci bir yöntem, Tiyobarbitürik Asit Reaktif Maddeler (TBARS) Analizi, özellikle lipid peroksidasyonu hakkında daha fazla bilgi sağlamak üzere uygulandı. TBARS Analizi 30µM sisplatin NAC olmadan 24h uygulandığında wt için yaklaşık 8.4 kat ve p53-/- için yaklaşık 5.9 kat artış gösterdi fakat NAC verildiğinde wt için 75% azalış gözlendi. 30µM sisplatin NAC olmadan 48h uygulandığında ise, wt için yaklaşık 1.5 kat ve p53-/- için yaklaşık 1.8 kat artış gösterdi fakat NAC verildiğinde wt için %13 ve p53-/- için %39 azalış gözlendi. Bu bölümde elde edilen data ROT ve lipid peroksidasyonu seviyelerinin sisplatin uygulamasına bağlı olarak arttığını ve bunun aktioksidan verilerek geri çevrilebildiğini gösterdi.Daha sonraki deneylerde, OxyBlot? tekniği total protein izolasyonları ve immünçökeltme yöntemiyle total protein izolasyonlarından ayıklanmış Bcl-2 ailesi proteinlerinden kalım-yanlısı Bcl-2, Mcl-1 ve Bcl-xL proteinleri için kullanıldı. Teknik artan sisplatin dozları (0, 20, 30, 60µM) ile protein karbonilasyonunun arttığını ve 30µM sisplatin ve antioksidan ile TP53 geninin yokluğu durumunda kalım-yanlısı proteinlerin üçünün de saptanabilir karbonilasyon sinyalleri verdiğini gösterdi. Bu da bu çalışmanın başlangıçtaki önsavı olan bu deney düzeneğinde kalım-yanlısı proteinlerin protein modifikasyonları nedeniyle işlev kaybına uğramalarının apoptotik cevaba katkıda bulunması fikrini destekledi.Bu sonuçlar özellikle apoptoz ve hücre içi oksidatif stres bağlantılı sinyal kademeli dizilerinin ışığında tartışıldı. Sisplatinin hücrenin genel yükseltgenme-indirgenme durumunu etkilemek suretiyle apoptozu indüklediği bulunduğundan sisplatin uygulamasına hassaslaştırılma anlayışı bu çalışmanın gelecekteki olası uygulamaları için ilgi çekici bir yaklaşım olabilir.

In this study primarily response to CDDP administration in terms of cell viability was examined. For demonstration of cell viability in response to CDDP treatment, MTT Assay was used in the absence or presence of the antioxidant, N-Acetyl-L-Cysteine (NAC) pre-treatment. It showed around 19% decrease in cell viability for wt and 21% for p53-/- in the absence of NAC at 24h and 30µM CDDP. It also revealed around 72% decrease for wt and 31% decrease for p53-/- in the absence of NAC at 48h and 30µM CDDP, yet in the presence of NAC the cell viability was found to be favoured by almost 20% for wt. To assess the extend of apoptotic response in the absence or presence of NAC pre-treatment Flow Cytometric Analyses by Annexin-V Labelling was applied. It revealed around 1.6 fold increase for wt and 2.4 fold increase for p53-/- in the absence of NAC at 24h and 30µM CDDP, yet in the presence of NAC the apoptotic response was found to be repressed by almost 20% for wt and 40% for p53-/- It also showed around 4.7 fold increase for wt and 2.6 fold increase for p53-/- in the absence of NAC at 48h and 30µM CDDP, yet in the presence of NAC the apoptotic response was found to be repressed by almost 57% for wt. The data showed that wt and p53-/- cells differed in cell viability depending on the dose of CDDP and antioxidant pre-treatment, indicating that some fraction of the apoptotic response was due to increased ROS levels.In addition, DCFH-DA was exploited as the label for ROS in Flow Cytometric Analyses. Flow Cytometry showed around 4 fold increase for wt and 3.2 fold increase for p53-/- at 24h and 30µM CDDP yet in the presence of NAC the increase of ROS was found to be repressed by almost 50% for wt. It also revealed around 5.2 fold increase for wt and 5 fold increase for p53-/- in the absence of NAC at 48h and 30µM CDDP, yet in the presence of NAC the increase of ROS was found to be repressed by almost 66% for p53-/-. A second method, Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) Assay was used to gain more insight, this time in terms of lipid peroxidation. TBARS Assay revealed 8.4 fold increase for wt and 5.9 fold increase for p53-/- in the absence of NAC at 24h and 30µM CDDP, yet in the presence of NAC the increase was found to be repressed by almost 75% for wt. It also showed around 1.5 fold increase for wt and 1.8 fold increase for p53-/- in the absence of NAC at 48h and 30µM CDDP, yet in the presence of NAC the increase was found to be repressed by around 13% for wt and 39% for p53-/-. Data acquired in this section indicated increased ROS and lipid peroxidation levels with CDDP treatment which could be overcome by NAC pre-treatment.In further experiments, OxyBlot? procedure was applied to total protein isolates and also to the pro-survival proteins of the Bcl-2 family proteins, Bcl-2, Mcl-1 and Bcl-xL, fished out of the total protein suspensions via immunoprecipitation. The technique gave the picture of an increased protein carbonylation with increasing doses of CDDP (0, 30 and 60µM CDDP) and also exhibited that all three pro-survival proteins gave detectable carbonylation signal in the absence of the antioxidant and TP53 gene at 30µM CDDP, supporting the initial hypothesis of this work that loss of function of pro-survival proteins due to protein modifications contributes to apoptotic response in this experimental setup.These results were discussed in the light of intracellular signalling cascades, especially those related to apoptosis and intracellular oxidative stress. As CDDP was found to be inducing apoptosis via affecting the overall redox status of the cell and the concept of sensitization to CDDP treatment could be an interesting approach for possible future applications of this work.