Application of biotechnological tools to model plant, Brachypodium distachyon

Abstract

Brachypodium distachyon, tahılları ve yem bitkilerini içeren çim familyasını (Poaceae) temsil etmesi sebebi ile yakın zamanda model bir bitki olarak sunulmuştur. Bu çalışmada, Türkiye'nin farklı coğrafi bölgelerinden toplanan Brachypodium distachyon ile saf hatlar oluşturmak ve bu çeşitlilik içeren kolleksiyonu morfolojik ve sitolojik olarak karakterize etmek amaçlanmıştır. Bunun yanısıra, seçilen üç genotip için etkin bir doku kültürü sistemi ve partikül bombardımanı ve Agrobacterium aracılığı ile gen aktarım yöntemlerini kullanarak bir transformasyon sistemi kurulmuştur.Hatların fenotipik karakterizasyonu ve Brachypodium tohumlarından yapılan makro-/mikroelement analizleri geniş bir çeşitlilik ve belirgin farklılıklar göstermiştir. Olgun embriyoların kallus oluşturma oranlarının (%50 - %100) ve bu kallusların rejenerasyon kapasitelerinin (%11.7 - %52.3) genotipe bağlı olduğu bulunmuştur. Her genotip farklı doku kültürü şartlari ortaya koymuştur. Kallusların GUS (ß-glucorinidaz) geni ile partikül bombardımanı sonucunda, tüm üç genotip içinde %28.7 ortalama geçici gen aktarım etkinliği görülmüştür. Kalluslara gen aktarımında; Agrobacterium tumefaciens suşları (EHA105, LBA4404 ve AGL1), ilk ikisi kanamisin antibiyotiğine direnç (nptII geni) ve sonuncusu glufosinate amonyum bazlı herbisitlere dayanıklılık göstererek (bar geni), iki farklı büyüklükte altın partkülleri yada jilet ile yaralanmış kalluslara gen aktarımında kullanılmıştır. GUS geni ifadesi 0.0 ile 10.4 (GUS odakları/kallus) arasında değişmektedir. Tüm parametrelerin geçici gen ifadesi verimi üzerinde anlamlı bir etkisi olduğu bulunmuştur.Bilim camiasi için mevcut olan karakterize ettiğimiz bu germplasm koleksiyonu (146 saf hattın 116 tanesi diploid) ve bu araştırmada doku kültürü ve gen aktarımı çalışmaları için ilk kez kullanılan hatlar, Brachypodium ve enerji çimlerini de içeren diğer çim türlerinde ileride yapılacak olan genetik ve genomik çalişmaları destekleyebileceklerdir.

Brachypodium distachyon has recently emerged as a model plant species for the grass family (Poaceae) which includes cereal crops and forage grasses. In the present study, it was aimed to create inbred lines of Brachypodium distachyon that were collected from different geographic regions of Turkey and characterize this diverse collection morphologically and cytologically. Besides, an efficient tissue culture and a plant transformation system using microprojectile bombardment and Agrobacterium-mediated gene transfer methods for three selected genotypes were established.Phenotypic characterization of the lines and macro-/microelement analysis in Brachypodium seeds showed extensive variation and significant differences. Callus formation percentages (50% to 100%) of the mature embryos and regeneration capacities of these calli (11.7% to 52.3%) were found to be genotype dependent. Each genotype displayed different responses to tissue culture conditions. Bombardment of the calli with the GUS (ß-glucorinidase) gene revealed an average transient transformation efficiency of 28.7% within all three genotypes. Agrobacterium tumefaciens strains (EHA105, LBA4404 and AGL1), first two conferring resistance to kanamycin (nptII gene) and the later to glufosinate ammonium based herbicides (bar gene), were used for the transformation of calli that were wounded by microprojectile bombardment with two different sizes of gold particles or cutting with a blade. The GUS expression ranged from 0.0 to 10.4 (GUS foci/callus). All parameters were found to have significant effect on transient gene expression efficiency.Our well-characterized germplasm collection (146 inbred lines and 116 of them diploid) is freely available for scientific community and the lines that were used for the first time in this research for plant tissue culture and transformation studies could aid for further genetic and genomics studies in Brachypodium and other grass species including energy grasses.