The role of CD3 delta interacting proteins in T cell receptor assembly and signaling

Abstract

T hücresi reseptör (TCR-CD3) kompleksinden başlayan sinyaller, hem T hücrelerinin düzgün işleyişi hem de farklılaşması ve hayatta kalması için önemlidir. CD3 zincirleri, TCR ve preTCR komplekslerinin oluşmasında ve sinyal iletiminde önemli rol oynarlar, ancak bu kadar çeşitli CD3 zinciri varlığının ardındaki mantık günümüze değin tam olarak açıklanabilmiş değildir. Biz bu çalışmada, CD3delta zinciriyle etkileşime giren yeni proteinler bulmayı hedefledik. Bu amaçla Dual membran sistemi olarak adlandırılan, split-ubiquitin prensibine dayanan maya ikili hibrid sisteminden faydalandık. Bu yeni sistem, hücre membranında bulunan proteinlerin etkileşimde bulundukları diğer proteinleri belirlemeye olanak vermektedir. Araştırmamızda, bu yeni sistem yardımıyla, CD3delta ile etkileşime giren proteinleri bulmak amacıyla, CD3delta zincirini olta olarak kullanarak, Jurkat hücresi cDNA kütüphanesi taranmıştır. Belirlenen etkileşimlerin in-vivo önemini insan hücre kültürü hatlarında immun çökeltme metodu ile doğrulanmıştır. CD3delta ile etkileşime giren proteinlerden iki tanesi BCAP31 ve CD81 detaylı olarak incelenmiştir. Daha önceden B hücresi reseptörüyle etkileşimi gösterilmiş olan BCAP31'in, CD3delta ile endoplazmik retikulumda etkileşmekte olduğu ve TCR oluşumunda olası bir rol oynadığı gösterilmiştir. Tetraspanin ailesine ait olan CD81'in de daha önceden yapılmış olan araştırmalarda T hücresi gelişiminde rol oynadığı belirtilmiştir. Bu çalışmada CD3delta ile etkileşime girdiği gösterilen CD81'in işlevsel rolünü araştırmak için, T lenfosit hücre hatlarında shRNA kullanarak CD81 ifadesini susturduk. Yapılan işlevsel çalışmalar sonucunda T lenfositlerinde, CD81'in TCR/CD4 coreseptör bağımlı sinyal iletiminde önemli olduğu ve bu etkinin TCR sinyallerinin başlamasında muhtemel engelleyici bir rolü olduğu sonucuna varılmıştır.

The signals initiated from the T cell receptor (TCR)-CD3 complex receptors are not only important for the correct functioning but also for the differentiation and survival of T cells. While CD3 chains play an essential role in the assembly of and signaling by the TCR and preTCR complexes, the logic behind the redundancy of these signaling subunits has not been addressed. In this study, we aimed to identify novel proteins that interact with the CD3delta subunit of the TCR complex. We performed a membrane based split ubiquitin yeast two hybrid screen. This novel genetic screening system allows the identification of interaction partners of membrane-associated proteins. We used the CD3delta chain as bait and screened a Jurkat cell cDNA library to identify CD3 interacting proteins. We confirmed the in-vivo relevance of these interactions by co-immunoprecipitation in human tissue culture cell lines. We further examined the functional significance of two CD3delta interacting proteins: BCAP31 and CD81.We demonstrate that BCAP31, previously shown to associate with B cell receptor, interacts with CD3delta ? in the endoplasmic reticulum (ER) and plays a role in TCR assembly. We also identified the tetraspanin superfamily member CD81, previously shown to have a role in early T cell development, as a CD3delta interaction partner. In order to investigate the functional significance of this interaction, we silenced CD81 expression in T lymphocyte cell lines by shRNA mediated expression arrest and performed functional assays. We demonstrate that CD81 is important for TCR/CD4 co-receptor mediated signaling of T lymphocytes, possibly inhibiting the initiation of TCR signals.