The role of CD3 delta and Rag1Ap1 proteins in T cell receptor expression

Abstract

T hücresi reseptörünün (TCR) CD3 zincirleri, T lenfositlerdeki bu reseptör komplesinin oluşumu ve sinyal iletişimi için gereklidir. Bu çalışmanın ilk bölümünde yapay bakteri kromozomlarında rekombinasyon teknikleri kullanılarak CD3 delta zincirini koşullu olarak silmeyi amaçladık. Fare embriyonik kök hücrelerinde CD3 delta gen bölgesini hedefleyen plazmidler oluşturduk. Çalışmanın ikinci bölümünde, maya ikili hibrit taramasında CD3 delta ile etkileşimi olduğu belirlenen Rag1Ap1 isimli bir proteine odaklandık. CD3 delta ve Rag1Ap1 etkileşimini HEK293T hücrelerinde immün çökeltme yaparak doğruladık. CD3 delta ? Rag1Ap1 etkileşiminin hücre içindeki lokasyonunu incelemek icin Rag1Ap1 ? Venus (YFP) füzyon proteinini ifade eden bir plazmid oluşturduk. Rag1Ap1 ? Venus füzyon proteininin hücre içindeki lokasyonunu transfeksiyon yapılmış HeLa hücre hatlarında floresan ve konfokal mikroskop ile analiz ettik. Ayrıca, T lenfosit hücre hatlarında Rag1Ap1 ifadesinin arttırımının ve shRNA yoluyla Rag1Ap1 baskılamasının TCR ifadesi üzerindeki etkilerini akım sitometresinde belirledik. Bu deneyler Rag1Ap1'ın CD3 delta ile etkileşiminin endoplazmik retikulumda olduğunu ve bu etkileşimin TCR oluşumu ve hücre yüzeyindeki ifadesinde rol oynayabileceğini göstermektedir.

CD3 subunits of the of T cell receptor (TCR) are essential for the assembly and signal transduction initiated from this receptor complex in T lymphocytes. The first part of this study aims to generate a CD3 delta conditional knockout construct by recombineering bacterial artificial chromosomes. We generated multiple plasmids that were designed to target the CD3 delta gene locus in mouse embryonic stem cells. In the second part of the study, we focused on a CD3 delta interacting protein called Rag1Ap1, which was identified in a yeast two hybrid screen. We confirmed the interaction of CD3 delta and Rag1Ap1 by co-immunoprecipitation in HEK 293T cells. To study the subcellular localization of the CD3 ? Rag1Ap1 interaction, we generated a plasmid expressing a Rag1Ap1 ? Venus (YFP) fusion protein. We analyzed the subcellular localization of the Rag1Ap1-Venus protein by fluorescent and confocal microscopy in transfected HeLa cell lines. Furthermore, we tested the effect of the overexpression and shRNA mediated knockdown of Rag1Ap1 on TCR expression levels in T lymphocyte cell lines, by flow cytometry. These experiments indicate that Rag1Ap1 interacts with CD3 delta in the endoplasmic reticulum and may play a role in TCR assembly and surface expression.