Apsergillus niger as an expression system for heterologous production of ROL and BTL2

Abstract

Bacillus thermocatenulatus lipazı (BTL2) ve Rhizopus oryzae lipazı (ROL), pAL85 plazmidinde, konstitütif promoter pkiA ve sonlandırıcı trpC dizilerin kontrolü altına klonlandı. Oluşturulan plazmidler, ipliksi bir mantar olan Aspergillus niger organizmasının 872.11 suşunu transforme etmek için kullanıldı. Transforme olan koloniler PCR ile doğrulandıktan sonra Rhodamine içeren katı besi yerinde pozitif sonuç veren suşların sıvı kültürleri yapıldı. Bu kültürlerden alınan örneklere çeşitli analiazler uygulandı. BTL2 ile transforme olmuş hücrelerde SDS jel ve zimogram sonuçları, BTL2'nun üretildiğini gösterdi. Aktivite ve Bradford testleri de bu sonuçlarla paralellik gösterdi fakat sonuçlar tekrar edilebilir değildi. Yapılan hesaplamalı analizler sonucunda bu proteinin A. niger'da yüksek seviyede üretim için uygunolmadığı görüldü. ROL ile transforme edilmiş suşlardan, SDS jelinde bant görülemedi. Aktivite testi de belirgin bir sonuç vermedi. Bu düşük verimin sebebini açıklamak üzere Rhizopus oryzae ve Aspergillus niger'in kodon kullanım tabloları incelendi.

Lipases are esterases that hydrolyze lipids to fatty acids and glycerides. These enzymes have a variety of functions, thus applications, making them attractive targets to be studied. In this study, Bacillus thermocatenulatus lipase 2 (BTL2) and Rhizopus oryzae lipase (ROL) were cloned in pAL85 expression vector under control of constitutive pkiA promoter and trpC terminator. Aspergillus niger 872.11 protoplasts were transformed with these constructs. Transformation was confirmed by PCR from genomic DNA, lipase production was screened on Rhodamine-containing plates and positive strains were selected for shake flask cultures. Samples taken from the shake flask cultures were subjected to further analysis. SDS-PAGE and zymogram assay of BTL2 transformants showed that two transformants were expressing BTL2. Results of activity assay against 4-MU-caprylate and Bradford assay were also consistent with this data. But the results were not reproducible. Computational analysis showed that the enzyme was not suitable for high level expression in A. niger. No bands for ROL transformants could be detected on SDS-PAGE analysis. Activity assay against 4-MU-caprylate did not show a significant activity either. Differences in codon usage preferences between Rhizopus oryzae and Aspergillus niger were investigated in order to suggest an explanation for low efficiency.