Characterization of A. thaliana G-protein gamma subunit (AGG2) and investigation of DTT effect on its oligomeric state

Abstract

Hetertrimerik G Proteinleri bitki ve hayvan hucrelerınde sinyal devamlılık yolakları üstünde önemli yere sahiptirler. Hücre içine sinyali membrana bağlı bulunan reseptörlerden alıp aşağı yönde bulunan diğer faktörlere iletirler (Simon M. I., 1991). Protein kompleksi ? ß ve ? şeklinde üç altbirimden oluşmaktadır. Alfa altbirimi GTP hidroliz aktivitesini üstlenmekle beraber sinyal devamlılığı ya da durdurulmasını kontrol eden moleküler bir anahtar görevi görmektedir. Beta ve gama altbirimleri ise aşağı sinyal iletimini dimer olarak beraber yapmaktadırlar (Oldham, 2006). Memeli organizmalarında G-Proteinkeri koku, tat ve ışık algılama yolaklarına güçlü bir şekilde entegre olmuşlardır. Bitki hücreleri ise G-Proteinlerini filizlenme, hücre bölünmesi, stres tepkileri ve morfolojik değişim anlarında kullanmaktadır (Perfus-Barbeoch L., 2004).Bu çalışma A. Thaliana G-proteini gama altbirimi olan AGG2?nin biyofiziksel karakterizasyonu üstüne literatürde bulunan ilk çalışmadır. Gen, E.coli TOP10 hücrelerinde pETM-41 ve PMCSG-7 plazmidlerinin yardımları ile sentezlenmiştir. Sentezlenen proteinin ekspresyon profili ve protein sentezleyen ve sentezlemeyen TOP10 hücrelerinin büyüme eğrileri optimize edilmiştir. Proteinler afinite, ion değişim ve boyut çıkarım (size exclusion) kromatografileri ile saflaştırılmış ve ?Dynamic Light Scattering?, ?Circular Dichroism? ve ?Small Angle X-Ray Scattering? metodları ile karakterize edilmiştir. AGG2 protein sekansının memeli G-protein?lerinden olan ?transducin? proteininin gama altbirimi ile hizalanma sonucunun programa girilmesi ile homoloji modelleme yapılmış, modelleme sonucu kendi üstüne yerleştirilerek bir dimer elde edilmiş ve yapısı incelenmiştir.Protein ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması sonucu görüldü ki pETM-41 klonlaması ile elde edilen plazmid proteininin saflaştırmasında yeterli protein miktarına ulaşılamamıştır, fakat pMCSG-7 (AGG2) ile daha önceden elde edilmiş pQE80-L (AGG2*) plazmidlerinde AGG2 sentezi biyofiziksel çalışmalar için yeterli miktarda elde edilmiştir. AGG2 ve AGG2* SEC kolonu sonucunda farklı boyutlarda ayrıştırılmış ve farklı boyutlarda iki protein görülmüştür. Bu farklılık proteinlerin saflaştırıldığı tampon solüsyonda bulunan/bulunmayan DTT indirgeme kimyasalına dayandırılmıştır. Tampon içinde bulunan DTT?nin protein boyutlarını küçülttüğü gözlemlenmiştir. Artan DTT konsantrasyonları ile yapılan (0 mM?den 5 mM?e kadar) DLS, CD ve SAXS deneylerinde artan DTT miktarı ile protein oligomer durumunun tetramerden dimere geçtiği görülmüştür. Oligomer durum değişiminin protein konsantrasyonuna bağlı olmadığı da kanıtlanmıştır. Homoloji modelleme sonuçları SAXS deneylerinden elde edilen verilerle yapılan ab initio modellerle ve memeli hücresinde bulunan homologlari ile uyumluluk göstermektedir. Modelleme sonuçlarından elde edilen yapılardan elde edilen teorik SAXS eğrileri ile deneysel eğriler karşılaştırılmış ve uyumluluk gösterilmiştir. Dimer oluşumunun gama altbiriminin fonksiyonunu etkilemesi hali hazırda bulunan literatür bilgisi ile tartışılmıştır. Modelleme ve biyofiziksel karakterizasyon çalışmalarıö dimer formunun oluşumunun, homoloji modellemelerinde de gözlenen iki monomerin iç içe geçen C-terminus uçlarındaki loop? yapılarının oluşturduğu yapının içinde gizlenen Cys108 amino asidi olduğu sonucuna varılmıştır.

Heterotrimeric G-Proteins are vital effectors in signal transduction pathways in both animal and plants by transmitting the signal received by membrane bound receptors to downstream factors (Simon M. I., 1991). The protein complex consists of three subunits: ?, ß and ?. The alpha subunit has GTP hydrolysis activity and acts as a molecular switch for signal continuity or inhibition. Beta and gamma subunits act as a dimer for downstream signal transduction (Oldham, 2006). Odor, taste and phototransduction pathways are closely integrated to G-Protein transduction mechanism in mammalian organisms (Arshavsky V. Y., 2002). Plant cells utilize G-Protein signaling in germination, cell division, stress responses and morphological changes (Perfus-Barbeoch L., 2004).This study is the first report in the literature for biophysical characterization of the A. thaliana G-Protein ? subunit, AGG2, independent of beta subunit. The gene was expressed in E. coli TOP10 cells using pETM-41 and pMCSG-7 vectors. Expression profiles of the proteins and growth curves of TOP10 cells with or without protein overexpression were optimized. The proteins were purified with affinity, ion exchange and size exclusion chromatography and were characterized with Dynamic Light Scattering (DLS), Circular Dichroism (CD) and Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) methods. Furthermore alignment of AGG2 to mammalian G-Protein, transducin, gamma subunit was carried out and this was utilized for homology modeling. The monomer model was self-docked and the structural features of the dimer were further investigated.Protein expression levels were such that the pETM-41 clone yielded insufficient protein for purification but pMCSG-7 clone (AGG2) and a previously prepared pQE80-L clone (AGG2*) could be utilized in biophysical characterization studies. Proteins AGG2 and AGG2* were obtained from the SEC column at different elution volumes indicating different properties for the same protein under the different conditions of SEC. This effect was traced back to presence/absence of DTT in elution buffers. Presence of DTT in the buffer resulted in a change in the size of the protein. DLS, SAXS, CD measurements as a function of DTT concentration (from 0 to 5 mM) showed that the protein changed its oligomeric state from tetramer to dimer as DTT concentration is increased and it has been possible to reduce this form to monomeric state. This effect was found to be independent of protein concentration. Homology modeling resulted in structures that were in agreement with those found from ab initio modeling based on SAXS data as well as that obtained from crystal structure of mammalian beta-gamma dimer. Theoretical SAXS curves obtained from the homology model of the dimer overlap well with the experimental SAXS curves. Significance of the dimer for function of the gamma subunit is discussed within the perspective of available literature on the plant G-protein heterotrimer. Modeling and biophysical characterization studies led to the conclusion that the dimeric form results from interaction of Cys108 of two monomers which are located in an intertwined ball like structure formed by C-termini loops of two monomers.