Cloning and expression of beta subunit (AGB1) of heterotrimeric G-protein complex from a.thaliana

Abstract

Heterotrimerik G proteinleri, hücre zarı yüzeyinde bulunan reseptörlerin uyarılmasıyla hücre içinde tepki oluşumuna neden olarak sinyal iletiminde moleküler anahtar olarak görev yaparlar(Oldham, 2006). Heterotrimerik G proteinleri alfa, beta ve gama alt birimlerinden oluşur. Memeli hücrelerinde G proteinleri en yaygın sinyal iletim sistemlerini oluştururlar. Duyuların algılanması, hücre büyümesi ve hormonal düzenlemede rol alırlar. Bitkilerde ise G proteinleri, tohum çimlenmesi ve fide gelişiminden kök gelişimi ve organların şekillerinin belirlenmesine kadar birçok gelişimsel süreçlerde rol alırlar(Chen, 2008).Bu çalışmada, A.thaliana heterotrimerik G-proteini beta altbiriminin(AGB1) pMCSG7 vektörü kullanılarak E.coli hücrelerinde ekspres edilmesi amaçlanmıştır. Bu sistemde, protein bir his etiket(his-tag)ile ekspres ifade edilir ve sonrasında vektörden gelen TEV(Tobacco etch virus) tanıma bölgesinden TEV proteaz ile kesilerek histidin etiket bölgesi uzaklaştırılır. AGB1geninin pMCSG7 vektörüne yerleştirilmesinde LIC (ligation independent cloning) klonlama yöntemi kullanıldı. Bu yöntem genin restriksiyon bölgelerinden ve ligazdan bağımsız olarak klonlanmasını sağlar.AGB1 geni (pMCSG7 vektöründe) Top10, DH5? ve BL21plus* E.coli hücrelerinde ifade edildi ve optimum gen ifadesi BL21plus* hücrelerinde görüldü.Burada beklenti, bu ekspresyonu optimum hale getirip proteini daha saf halde elde etmekti.AGB1 proteinin saflaştırılmasında afinite, iyon değişimi ve moleküler elek kromatografisi yöntemleri kullanıldı.Bu çalışmaya ek olarak laboratuvarımızda TEV proteazın ifadesi ve saflaştırılması ile ilgili protokolün geliştirilmesi de amaçlanmıştır. TEV proteaz geni içeren pMHTDelta238 vektörü transformasyon yöntemi ile BL21De3 hücrelerine aktarıldı. Yapısında histidin etiketi bulunduran TEV proteaz ifade edilip afinite kromatografisi yöntemi ile saflaştırıldı. TEV proteazın aktivitesi kontrol BTL2 proteini ile western yöntemi uygulanarak doğrulandı.AGB1 proteini ayırma ve saflaştırma yöntemleri sonucunda TEV proteaz ile kesilerek histidin etiketi uzaklaştırılmaya çalışıldı.Sonuçlar western yöntemi ile incelendi. TEV proteaz ile kesme işlemindeki verim western yönteminde protein örneklerinin yaptıkları ışımaya göre doğrulandı.

Heterotrimeric guanine nucleotide-binding proteins(G proteins) act as molecular switches in signaling pathways by coupling the activation of receptors at the cell surface to intracellular responses.The heterotrimeric G protein complex consists of alpha, beta and gamma subunits. G proteins are the most prevalent signaling systems in mammalian cells, playing a role in the regulation of sensory perception, cell growth and hormonal regulation. In plants, G proteins play regulatory roles in multiple developmental processes ranging from seed germination and early seedling development to root development and organ shape determination. Our group is involved in structural studies of G proteins from Arabidopsis thaliana and the work presented in this thesis contributes to the development of purification process of AGB1 protein in E.coli.The aim of this study was to express the A.thaliana beta subunit (AGB1) in E.coli using pMCSG7 vector. In this system the protein is expressed with a his-tag which can be removed after digestion with tobacco etch virus (TEV) protease at the TEV cleavage site introduced from the vector. For cloning AGB1 gene into pMCSG7 vector, ligation-independent cloning (LIC) which allows insertion of DNA fragments independent of restriction sites and ligases was used. The AGB1 gene (in pMCSG7 vector) was expressed in Top10, DH5α and BL21plus* E.coli cells. The optimum protein expression was observed in BL21plus* cells. Efforts focused on optimization of protein expression and on obtaining AGB1 in a pure state by developing a purification protocol involving affinity, ion exchange and size exclusion chromatography.Another aim of this study was to establish the protocols for expression and purification of Tobacco Etch Virus (TEV) protease in our lab in order to cleave the his-tag from AGB1 efficiently in a cost effective way.pMHTDelta238 vector (with TEV protease gene) was introduced intoBL21De3 cells. His tagged TEV protease was expressed and isolated with affinity chromatography. The activity of TEV protease was confirmed using a control protein called BTL2 and western blot analysis.The purified AGB1 protein was cleaved with TEV protease to remove the his-tag. Results were observed by western blot and the efficiency of cleavage with TEV protease was verified by comparing uncleaved and cleaved AGB1 protein samples.