Generation of Xanthomonas derived TALE proteins that inhibit gene transcription

Abstract

Bu çalışmanın ilk bölümünde IL7R alfa gen bölgesindeki çeşitli transkripsiyon faktör bağlanma bölgelerinde oluşturulan transcription activator-like effector (TALE) nükleaz (TALEN) plazmidleri ile mütasyonlar oluşturmayı amaçladık. IL-7R geninin enhancer bölgesindeki NF-kappaB, Notch ve GR bağlanma bölgelerini hedefleyen 3 çift TALEN plazmidini oluşturduk. TALEN plazmidlerini hücrede ifade ederek mütasyonlu hücre hatları oluşturduk ve bu mütasyonların IL7R ifadesine etkisini araştırdık. Neuro-2a ve RLM11 hücre hatlarında oluşturduğumuz mütasyonları modifiye edilmiş RFLP yöntemi ile DNA sekanslaması ile belirledik. NF-kB bağlanma bölgesindeki mütasyonların IL-7R ifadesinde azalmaya neden olduğunu, Notch bağlanma bölgesindeki mütasyonların ise IL-7R ifadesini değiştirmediğini gözlemledik. Bu çalışmanın ikinci bölümünde, NF-kB proteinlerinin transkripsiyon aktivasyonundaki rolünü NF-kB bağlanma bölgelerine kompetitif olarak bağlanan TALE proteinleri ile inhibe etmeyi amaçladık. TNF-alfa uygulanmasına NF-kB translokasyonu sonucunda GFP ifadesi ile cevap veren reporter hücre hattındaki NF-kB bağlanma bölgesine bağlanacak TALE-dsRed füzyon proteinleri ifade eden plazmidler oluşturduk. TALE-dsRed füzyon proteinlerinin NF-kB proteininin bağlanmasini kompetitif olarak inhibe ederek reporter hücrelerde GFP ifadesini azalttığını gözlemledik. Çalışmalarımız, TALE ve TALEN proteinlerini gen transkripyonunu baskılayabileceğimizi göstermektedir.

In the first part of this study, we aimed to mutate several transcription factor binding sites in the IL-7R alpha gene locus by generating transcription activator like effector (TALE) nucleases (TALEN) targeting these sites. We designed, constructed and expressed 3 pairs of TALENs targeting the NF-kappaB, Notch, and glucocorticoid receptor (GR) binding sites in the IL7R gene enhancer. We generated cell lines with insertion and deletion (INDEL) mutations induced by these TALENs at these target sites and determined the effects of these mutations on IL-7R alpha gene expression. We assessed TALEN induced mutations in murine Neuro-2a and RLM11 cell lines by a modified restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay and by DNA sequencing. We demonstrate that mutations induced by TALEN pairs targeting the IL7R enhancer NF-kappaB site reduce IL-7R alpha gene expression, while mutations in the Notch binding site did not change IL-7R expression. In the second part of this study, we aimed to inhibit the transcription activation function of the NF-kB protein by competitive binding of target sites with TALE proteins. We generated plasmids encoding TALE-dsRed fusion proteins that were designed to bind NF-kB binding sites in a reporter cell line. TNF-alpha treatment of this cell line results in NF-kB nuclear translocation and a resultant increase in GFP fluorescence. TALE-dsRed fusion proteins with increasing numbers of DNA binding repeats competed for NF-kB binding to this reporter and resulted in reduced GFP expression upon TNF treatment. Our experiments demonstrate that TALENs and TALEs can efficiently inhibit gene transcription.