Intracellular immunodynamics of lentiviral gene delivery in human natural killer cells

Abstract

Doğal Öldürücü (NK) hücreler doğal bağışıklık sisteminin kanser hücrelerini ve enfekte olmuş hücreleri hedef alan üyeleridir. Genetiği değiştirilmiş NK hücreleri kullanılan kanser immün tedavisi yaklaşımları klinik deneylerde umut verici sonuçlarla ilham kaynağı olmaktadır fakat NK hücrelerinde genetik değişiklik yöntemleri henüz ideal koşullara ulaşmamıştır. NK hücreleri lentiviral gen aktarımına diğer bağışıklık sistemi hücrelerine kıyasla yüksek direnç gösterirler. Geçmiş çalışmalar Toll-benzeri almaçlar ve RIG-I-benzeri almaçların sinyal yolaklarının aşağısındaki TBK1/IKKepsilon çiftinin küçük molekül inhibitörü BX795'in lentiviral gen aktarımı sırasında kullanımının NK hücrelerinde anlamlı verim artışına yol açtığını göstermiştir. Bu çalışma NK hücrelerine viral vektörlerin girişinde büyük sorunlar yaşanmadığını, fakat virüs karşıtı sinyallerin aktifleşmesi sonucu hücreiçi viral vektörlerin elenmesinin gerçekleştiğini göstermiştir. Bu yanıtta payı olan 20 aday genin rollerini araştırmak için CRISPR/Cas9 sistemi kullanılmış ve bu genler 293FT ve NK-92 hücre hatlarında mutasyona uğratılmıştır. Bizim sonuçlarımız virüsün kılıf bölgesinin 293FT hücrelerinde TRIM5alfa tarafından algılanmasının ve çift-sarmal RNA bazlı sinyallerin NK-92 hücrelerinde RIG-I ve TRIM25 üzerinden algılanmasının lentiviral gen aktarımına karşı dirençte önemli roller oynadıklarını göstermektedir. Buna ek olarak, viral vektöre maruz kalan hücrelerde MAPK aktivitesinde, özellikle vahşitip HIV enfeksiyonlarında görüldüğü gibi NK-92 hücrelerinde p38 ve JNK fosforilasyonunda artış olduğu gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışma lentiviral gen aktarımının NK hücrelerinde çeşitli kalıp tanıma reseptörleri tarafından doğuştan gelen bağışıklık sistemini uyardığını onaylamıştır. Genetiği değiştirilmiş NK hücrelerinin immün tedavide umut vaadeden uygulamaları için küçük molekül inhibitörlerinin kullanımı engelleri aşmaya yardımcı olacaktır.

Natural Killer (NK) cells are members of the innate immune system that target tumors and infected cells. Cancer immunotherapy approaches using genetically modified NK cells continue to inspire clinical trials with promising results but the protocols for genetic modification of NK cells are suboptimal. NK cells show strikingly high resistance to lentiviral gene delivery when compared to other cells of the immune system. Previous studies show that the use of BX795, a small molecule inhibitor of TBK1/IKKepsilon complex downstream of Toll-like Receptors and RIG-I-like receptors, significantly enhances lentiviral gene delivery to NK cells. This study shows that while viral vector entry to NK cells can take place without major problems, the activation of antiviral signaling pathways leads to intracellular elimination of the vector. To study the roles of 20 candidate genes in this process, the CRISPR/Cas9 system was used and single genes were knocked out in 293FT and NK-92 cell lines. We demonstrate that, capsid recognition by TRIM5alpha in 293FT cells and dsRNA-induced signaling through RIGI and TRIM25 in NK-92 cells are major players affecting lentiviral gene delivery. Additionally, viral vector exposure was shown to increase MAPK activity in host cells, specifically p38 and JNK phosphorylation in NK-92 cells, as observed in wildtype HIV infections. Overall, this study confirms that lentiviral gene delivery evokes an innate immune response in NK cells through multiple pattern recognition receptors and cellular restriction factors. Small molecule inhibitors help to overcome this obstacle for promising applications in immunotherapy using genetically modified NK cells.