Identification of immunological genes important for cytotoxicity

Abstract

Doğal Öldürücü (NK) hücreleri ve sitotoksik T-lenfositleri (CTL) vücudu yabancı hücrelere karşı korumak için önemlidir. Sitotoksisite mekanizmalarının ayrıntılı olarak anlaşılması daha yüksek sitotoksisiteye sahip genetiği değiştirilmiş hücreler üretme ve sitotoksisitelerini arttırmak için ilaçla hedeflenebilir bölgeler bulma şansı verir. Bu tezde, CTL'nin sitotoksisitesinde rol oynayan genlerin, NK-92 hücrelerinin sitotoksisitesinde de önemli olup olmadıklarını kontrol etmek için CRISPR/Cas9 sistemini kullandık. NK-92 hücrelerine plazmid transfeksiyonu ve tek hücreli klon yapmak zordur. Bu adımlar, CRISPR / Cas9 sistemi kullanarak mutasyona uğramış bir hücre popülasyonu oluşturmak için gereklidir. Neon Elektroporasyon transfeksiyon yöntemi ile NK-92 hücre hattına gen aktarımını optimize etmeye çalıştık, ancak CRISPR/Cas9 vektörünü yüksek transfeksiyon verimliliği ve yüksek hücre canlılığı ile hücreye gönderimini sağlayamadık. Besleyici hücre hattı, HSV-TK genli virüsün NK-92 hücre hattına transfer edilmesi ile üretildi. Tek NK-92 hücrelerini büyütmek için en iyi koşulu bulmak amacıyla farklı oranlarda ve farklı konsantrasyonlarda gansiklovir kullanılarak birlikte kültür deneyleri yaptık. Yaklaşık 17 NK-92 hücresinin 1:10000 oranı ve 0.01 µg/ml ila 1 µg/ml gansiklovir muamelesi sonucunda saf bir popülasyon oluşturduğunu belirledik. Seçilen genleri mutasyona uğratmak için, CRISPR/Cas9 plazmitleri, üçüncü nesil lentivirüs metotları ile iletildi. Mutasyonun varlığı ve hedef genin mRNA ifade seviyesindeki azalma, T7 tahlili ve QRT-PCR ile doğrulandı. Mutasyona uğramış popülasyonların sitotoksisitesi ve degranülasyonu Xcelligence deneyi ile kontrol edildi. Bu tez çalışmasında bazı genlerdeki mutasyonların NK-92 hücrelerinin MCF-7 hücrelerine karşı sitotoksisite yanıtlarının azalttığını belirledik.

Natural Killer (NK) cells and Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are essential to defend the body against foreign or transformed cells. An understanding of the mechanism of their cytotoxicity can result in the generation of genetically modified cells with higher cytotoxicity and to identify drug-targets that increase cytotoxicity. In this thesis, genes which have a role in the cytotoxicity of CTLs were targeted by the CRISPR/Cas9 system to check whether they also play a role in the cytotoxicity of Natural Killer cells (NK-92 cell line). These cells are difficult to transfect with plasmid DNA and to generate single cell clones. In this thesis we attempted to optimize the Neon Electroporation method for the NK-92 cell line. Unfortunately, we could not obtain high transfection efficiency and high cell viability. We thus performed gene transfer into these cells by lentiviral infection. In order to obtain single cell cloned NK-92 cells, we generated a feeder cell line by transduction with lentivirus encoding the HSV-TK gene into the NK-92 cell line. Cell containing the TK gene can be negatively selected by ganciclovir treatment. We performed coculture experiments with this feeder line mixed with ganciclovir resistant, unmodified NK cells at different ratios under different doses of ganciclovir selection. We were able to initiate a healthy culture starting with only 17 NK-92 cells, using a 1:10000 ratio of ganciclovir sensitive feeder cells selected under increasing doses of ganciclovir from 0.01 µg/ml to 1 µg/ml. To mutate selected cytotoxicity genes, we expressed CRISPR/Cas9 by third generation lentivirus. Presence of a mutation and a decrease in mRNA expression level of the target genes was confirmed by the T7 assay and QRT-PCR. The cytotoxicity of mutated pools were assessed by a degranulation assay and by Xcelligence real time cell analysis. We identified several genes that are important for the cytotoxic response towards the MCF-7 cell line.