Absans epilepsili sıçan hipokampusu: Ultrastrüktür, ultrastrüktürel immünositokimya, histokimyasal Timm`s metodu

Abstract

Hipokampus epileptik fenomen içerisinde hayvan modellerinde ve insanda çalışılmıştır. Yapılan çalışmalarda, lezyonlar sonucunda hipokampal yolakların nöroadaptif değişiklikleri gösterilmiştir. Eksitatör aminoasitler, santral sinir sisteminde normal ve patolojik durumlarda rol oynarlar. Bu nedenle epileptogenezde aminoasit reseptörlerinin eksitotoksik etkileri ilgi odağı haline gelmiştir. Sonuçlar nöbet sonucu ortaya çıkan nöronal hasarın eksitotoksik mekanizmalar aracılığıyla olduğunu ortaya koymuştur. Jeneralize absans nöbetlerinin patofizyolojisinde GABA ve eksitatör aminoasit aracılı mekanizmaların rolü vurgulanmıştır. Genetik absans epilepsili sıçanların (GAERS) talamusunda GABA'nın arttığı gösterilmiş ve bunun da nöbet başlangıcında rol oynadığı düşünülmüştür. Hipokampusta ise GABA'nın değişmediği ancak glutamatın arttığı gösterilmiştir. GAERS hipokampusunda azalmış âlân potansiyeli bu modelde yapısal olmaktan çok fonksiyonel değişiklikler olduğunu düşündürmüştür. Bu fonksiyonel değişiklikleri destekleyecek histolojik ve ultrastrüktürel bir çalışma yapılmamıştır. Çalışmamızda GAERS hipokampusunda morfolojiyi ortaya koymak ve buna dayanarak histopatolojik mekanizmaları aydınlatmak hedeflenmiştir. GAERS hipokampusunda nöron kaybı olup olmadığı ışık mikroskobu düzeyinde incelenmiş, aksonal filizlenme için Timm's sülfid gümüş metodu uygulanmıştır. Yüksek rezolusyonlu mikroskop ile ultrastrüktürel inceleme yapılmıştır. Anti-glutamat ve anti-GABA antikorlarının ince yapısal düzeyde uygulandığı immunositokimya yöntemi, yapı ve fonksiyon ilişkisini aydınlatmada kullanılmıştır. Ultrastrüktürel immunositokimya düzeyinde, inhibitor ve mossy terminallerinin alanları ile bu terminallerin GABA ve glutamat içerikleri kantitatif olarak değerlendirilmiştir. Bulgular, GAERS hipokampusunda nöron kaybı ve aksonal filizlenme olmadığını göstermiştir. Kantitatif veriler, dentat girustaki mossy terminal alanının azaldığını, CA3'te değişmediğini; bu terminallerdeki glutamat yoğunluğunun dentat girusta arttığını, CA3'te ise azaldığını ortaya koymuştur. Her iki bölgedeki inhibitor terminal alanlarında ve GABA yoğunluklarında değişiklik saptanmamıştır. Inhibitor terminallerin, GAERS grubunda, GABA(-) ya da GABA(+) dendritlerle sinaps yapmaları, bu modelde her üç tip (feedback, feed-forward, disinhibisyon) inhibisyonun olduğuna işaret etmiştir. Dentat girus bölgesinde GABA artışı olmamasına rağmen disinhibisyonun varlığı, bu bölgedeki glutamat artışının nedeni olabilir. GAERS'lerde hilar bölgede azalan mossy terminali alanı, granüler hücre aksonlarının filizlenmesinin bir belirtisi olarak düşünülmüştür. Bu bölgedeki glutamat artışı da, mossy terminallerin artmış olabileceği görüşünü desteklemektedir. Mossy terminallerinde glutamatla birlikte GABA'nın da bulunması, bunun yanında dentat girusta azalan, CA3'te değişmeyen mossy terminal alanına ters orantılı olarak dentat girusta artan, CA3'te azalan glutamat miktarı, GABA sentezine ilişkin farklı bir enzimatik yol olduğu ve glutamat havuzunun azalmadığı olasılığını düşündürmektedir. Hilar bölgedeki mossy hücre aksonlarının GABA(+) dendritik uzantılarla (spine) sinaps yapması, bu hücrelerin internöronlarla ilişkisini ; GABA(-) dendritik uzantılarla sinaps yapması ise, bir diğer mossy hücresi dendritiyle ilişki içinde olduklarını ortaya koymuştur. Bu da mossy hücrelerinin trisinaptik rekürran bir inhibitor döngüde rol aldıklarını göstermektedir. Bu çalışmada, GAERS'lerde GABAerjik ve glutamaterjik sistemde ultrastrüktürel düzeyde ortaya konan değişiklikler, aynı modelde yapılacak ileriki deneysel çalışmalar için temel oluşturabilir. 1

The hippocampus has been studied in the generation of epileptic phenomena in a variety of animal models of epileptic seizures and human epilepsy. Neuroadaptive changes in the hippocampal pathways have been shown in recent studies. Excitatory amino acids play an important role in normal neuronal functiohs, as well as in certain pathologic conditions. Therefore, interest has developed in the potential excitotoxic effects of amino acid receptors in epileptogenesis. The results from the studies suggest that neuronal injury following seizures may be mediated by an excitotoxic mechanism. The role of GABA arid excitatory amino acid mediated mechanisms hâs been implicated in the pathophysiology of generalized absence seizures. It has been shown that GA8A levels are increased in the thalamus of genetic absence epilepsy rats (GAERS) and this plays an important role in the generation of seizures. It was demonstrated that GABA levels were not changed compared to controls but glutamate levels were increased. Decreased field potential in the hippocampus of GAERS suggests there are functional, rather than structural changes in this model. There is no histological and ultrastructural evidence so far to support these functional changes. We aimed to show morphological changes and associated histopathological mechanisms in GAERS. We examined the hippocampus of GAERS at the light microscopical level to see if there is neuron loss. We used high resolution microscope for utltrastructural examination. Immunocytochemistry, in which anti-glutamate and anti-GABA antibodies are used, was used to understand the relation between the structure and the function. We examined the areas of inhibitory and mossy terminals and GABA and glutamate densities of these terminals quantitatively. Our results showed no neuron loss and axonal sprouting in the hippocampus of GAERS. Quantitative analysis demonstrated that the area of mossy terminals was decreased in the dentate gyrus but not changed in CA3 region of GAERS hippocampus, Glutamate density in these terminals was found to be increased in dentate gyrus but decreased in CA3. The areas of inhibitory terminals and their GABA densities were not changed in both CA3 and dentate gyrus. The synapses between the inhibititory terminals and GABA(-) and GABA(+) dendrites implicated three types of inhibition (feedback, feed forward, disinhibition) in GAERS. The synaptic contacts indicating disinhibition may be the reason of increased glutamate density in dentate gyrus of GAERS. The decreased mossy terminal area in hilar region is thought to be a result of axonal sprouting of granule cells. The increased glutamate density in dentate gyrus supports previous studies suggesting increased numbers of mossy terminals in this region. GABA and glutamate coexist in mossy terminals. Although the areas of mossy terminals in dentate gyrus were less than those of controls, the glutamate density was found to be higher in this region. The areas of mossy terminals in CA3 region were not changed but glutamate density was less than that of control. All of these findings suggest there might be a different enzymatic pathway in the synthesis of GABA resulting in a constant glutamate level in the metabolic pool. In the hilar region, the synapses between mossy cell axons and GABA(+) spines showed the interaction of these cells with the interneurons. The synapses between the former with the GABA(-) spines showed the interaction with another mossy cell. These observations implicate that mossy cells are involved in a trisynaptic recurrent inhibitory circuit in the dentate gyrus. The observed ultrastructural alterations in the GABAergic and glutamatergic systems in GAERS in this study might be a basis for future studies.