Hidrojel partiküllerin (p(AAc-AA) ) insan serumundan albumin ve immunoglobulin G saflaştırılmasında kullanılması ve saflık derecelerinin Hplc`de tayini

Abstract

ÖZETHİDROJEL PARTİKÜLLERİN (p(AAc-AA))İNSAN SERUMUNDAN ALBUMİN VE İMMUNOGLOBULİN GSAFLAŞTIRILMASINDA KULLANILMASI VE SAFLIK DERECELERİNİNHPLC'DE TAYİNİUÇARSU, FatmaKırıkkale ÜniversitesiFen Bilimleri EnstitüsüBiyoloji Anabilim Dalı,Yüksek Lisans TeziDanışman: Prof. Dr. M. Yakup ARICAOrtak Danışman: Doç. Dr. Gülay BAYRAMOĞLUEylül 2005, 47 sayfaAfinite kromatografi uygulamalarında destek materyalinin seçimi vehazırlanması kromatografik performansı etkileyen önemli faktörlerden birisinioluşturmaktadır ve özellikle hidrofilik karakterli hidrojellerin, bu alandakullanılmaları oldukça önemlidir. Bu doğrultuda, tez kapsamında partikül formdahidrojel yapıda akrilat kökenli polimerik destek materyallinin hazırlanması ve suluortamdan ve insan serumundan albumin (HSA) ve immunoglobulin G (HIgG)ayrıştırılması ve saflaştırılması işleminde afinite sorbenti olarak kullanılmasıamaçlandı. Hidrofilik karakterli poli(akrilikasit-akrilamid); p(AAc-AA) afinitehidrojeli, akrilik asit (AAc) ve akrilamit (AA) monomerlerinden amonyum persülfatPDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.combaşlatıcı varlığında UV fotopolimerizasyon yöntemi kullanılarak sentezlendi.Kromatografik alanda kullanmak amacı doğrultusunda geliştirdiğimiz serbestkarboksil ve amin gruplarına sahip p(AAc-AA) afinite hidrojelin herhangi biraktivasyon veya yüzey modifikasyon işlemine gerek kalmadan serum proteinlerineafinite gösterebilecek özellikte olması tasarlandı ve destek materyali olarak tekbasamaklı bir yöntemle hazırlandı. Hidrojel yapıdaki p(AAc-AA) afinite partiküllerinpH ve sıcaklığa karşı duyarlılık gösterdi. Geliştirilen affinite hidrojelin suluçözeltilerden ve insan serumundan HSA ve HIgG proteinlerini uzaklaştırılmasıçalışmaları farklı başlangıç protein konsantrasyonu, pH, iyonik şiddet, sıcaklık,adsorbent dozu gibi sistem parametreleri etkisi altında incelendi. Partikül yapıdakiafinite hidrojellerin sulu ortamdan maksimum HSA ve HIgG adsorpsiyonkapasiteleri sırası ile 93.35 ve 138.53 mg/g olarak bulundu. Hazırlanan afinitehidrojel ile sulu ortamdan HSA uzaklaştırılması işlemi Freundlich modeline uyarken,HIgG adsorpsiyonu için Langmuir ve Freundlich izoterm modelinin her ikisi ile ifadeedilebileceği belirlendi. Afinite partiküllerin adsorpsiyon kapasitesinde önemli birazalma olmaksızın adsorpsiyon-desorpsiyon işlemlerinde tekrar kullanılabildiğibelirlendi. 2.0 M NaCl (pH 5.0) desorpsiyon ajanı kullanıldığında afinitepartiküllerine adsorplanan HSA ve HIgG sırası ile yaklaşık %92 ve %88 oranındadesorbe edildi. p(AAc-AA) partikülleri ile insan serumundan HSA ve HIgG'ninsaflaştırma oranı HPLC yardımıyla sırası ile % 91.50 ve % 80.96 olarak belirlendi.Anahtar Kelimeler: Afinite partikül, Akrilamit, Akrilik asit, Adsorpsiyon Albumin,İmmunoglobulin G, HPLCPDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

ABSTRACTUTILIZATION OF HYDROGEL PARTICULES (p(AAc-AA)) IN PURIFICATIONOF ALBUMINE AND IMMUNOGLOBULINE G FROM HUMAN SERUM ANDDETERMINATION OF PURITY OF HSA AND HIgG BY HPLCUÇARSU, FatmaKırıkkale UniversityGraduate School of Natural and Applied SciencesDepartment of Biology, M.Sc.ThesisSupervisor: Prof. Dr. M. Yakup ARICACo-Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Gülay BAYRAMOĞLUSeptember 2005, 47 pagesIn affinity chromatography applications, the choice of matrix and its preparationprocess are the important factors affecting the chromatografic performance. Inparticular, hydrophilic hydrogels are used widely in this area. An hydrophilic affinitysorbent in particule form based on acrylate was syntesized. Purification andseparation of immunoglobulin G (HIgG) and Human Serum Albumine (HSA) ontothese affinity membranes from aqueous solutions and human serum was investigated.Poly(acrylicacid-acrylamide), p(AAc-AA), hydrogels were prepared from acrylicacid and acrylamide monomers via UV initiated photo-polymerization, in thepresence of an initiator ammonium persulphate. Free carboxyl and amine groupscontaining p(AAc-AA) hydrogels with high affinity to serum proteins were preparedPDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.comin a single step without the necessity of activation and modification process. p(AAc-AA) hydrogel particules are sensitive to pH and temperature. The effect of systemparameters such as initial protein concentration, pH, ionic strenght, temperature andadsorbent dosage on the removal of IgG and HSA from human serum wasinvestigated. The maximum HSA and HIgG adsorption capacity of p(AAc-AA)hydrogels were 93.35 and 138.53 mg/g, respectively. HSA removal from aqueussolution fitted to the Freundlich isotherm model while HIgG adsorption process fittedboth to the Langmuir and Freundlich isotherm models. Affinity particules could berepeatedly used in adsorption-desorption cycles without detectable losses in theiradsorption capacity. 92% of the adsorbed HSA and 88% of the adsorbed HIgG wasdesorbed by using 2.0 M NaCl (pH 5.0) as desorption agent. The purification rate ofHSA and HIgG from human serum was determined by HPLC and 91.5% and 80.6%,respectively.Keywords: Affinity particule, Acrylamide, Acrylic acid, Adsorption, Albumine,Immunoglobulin G, HPLCPDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com