Clinical and molecular factors effecting colistin resistance in K. pneumoniae

Abstract

Sağlık bakımıyla ilişkili enfeksiyonlar her yıl dünyada milyonlarca hastayı etkileyen önemli bir sağlık sorunudur ve ciddi kayıplara yol açar. K.pneumoniae dünyada sağlık bakımıyla ilişkili enfeksiyonların en önemli etkenlerinden biridir. Son yıllarda artan karbapenem direnci sebebiyle kolistin en son tedavi seçeneği olarak kullanilmaktadir. Ancak yapılan çalışmalarda kolistin direncinin artmakta olduğu ve önemli bir sağlık tehditi olmaya başladığı bildirilmektedir. PhoP/PhoQ ve PmrA/PmrB iki komponentli düzenleyici sistemlerdir ve gram negatif bakterilerde kolistin direncine neden olan genlerin ekspresyonlarını kontrol ederler. MgrB geni PhoP/PhoQ sisteminin regülatörü olan MgrB proteininini kodlar. Bu gende meydana gelen insersiyonal inaktivasyonlar ve mutasyonlar kolistin direnci ile ilişkilendirilmiştir. Bu çalışmada amacımız hastalardan elde edilen K.pneumoniae izolatlarındaki kolistin direncini belirleyen moleküler mekanizmaların klinik verilerle ilişkisini ortaya çıkarmaktır.Ankara Başkent Üniversitesi Hastanesi, İstanbul Başkent Üniversitesi Hastanesi ve Koşuyolu Devlet Hastanesinde tedavi gören 32 hastadan izole edilen kolistin dirençli K.pneumoniae suşları çalışmaya dahil edilmiştir. MgrB geninde transposon vey a mutasyon kaynaklı inaktivasyonun belirlenmesi için PCR amplifikasyonu ve ardından Sanger sekanslama methodu kullanılmıştır. Elde edilen ürünler NCBI'ın Blast aracı ve Genomics Workbench v.4.9 (CLC Bio, Aarhus, Danimarka) programı kullanılarak analiz edilmiştir. Ayrıca kolistin dirençli izolatlarda, PhoQ ve PmrK gen ifadelerindeki değişimler q-RT PCR metodu ile çalışılmıştır. Suşların klon analizleri rep-PCR yöntemi ile Diversilab Sistemi ile yapılmıştır (BioMérieux, Fransa). Tek değişkenli istatistiksel analizler için STATA 11 programı (Teksas, Amerika) kullanılmıştır.MgrB geninin transposon ile inaktivasyonu 32 izolatın 26'sında gözlenmlenmiştir. Bu transposonlar IS5 benzeri, IS1 benzeri, IS903 benzeri ve IS903B olarak sınıflandırılmıştır. Çalışma populasyonunda, 5 izolatın MgrB geninde çeşitli mutasyonlar bulunmuştur. PhoQ ve PmrK gen ifadelerinde önemli bir artış gözlemlenmemiştir.Klon analizi sonucunda üç merkezden toplanan hastaların iki farklı klona ait olduğugörülmüştür ( >%95 benzerlik). Relatif olarak genç yaşta olmak, yoğun akım ünitesinde kalmak transposon ilişkili kolistin direncinde rol alan klinik faktörlerdir( P<.005). Ortalama kolistin tedavi süresi transposonla inaktive olmuş MgrB pozitif K.pneumoniae ile infekte grupta 19 gün iken; transposonsuz MgrB grubunda infekte olan grupta 7 gündür (P=.231). Bu çalışma MgrB geninin inaktivasyonuna bağlı kolistin direncinin gelişmesinde rol alan klinik ve moleküler faktörleri gösteren ilk çalışmadır. MgrB geninin transposonlar ile inaktivasyonun kolistin direnci kazanılmasında en önemli moleküler mekanizma olduğu gösterilmiştir. Uzun süre yoğun bakım ünitesinde kalma ve daha genç yaşta olma, transposonla inaktive MgrB geni bulunan sus ile enfekte olma riskini artırır. Uzun süreli kolistin tedavisinin de bu dirençte etkili olduğu düşünülmektedir. Ayrıca, kolistin dirençli K.pneumoniae izolatlarının arasında yatay gen geçişinın gösterilmesi, kolistin direncininin halk sağlığını tehtid eden önemli bir problem olduğunu vurgulamaktadır.

Hospital acquired infections are one of the most important health issue affecting millions of patients and cause significant burden. Klebsiella pneumoniae (K.pneumoniae) which is one of the most common agents in worldwide are isolated from nosocomial infections. Colistin has been considered as the last choice of treatment for these infections since carbapenem resistance rate has been increasing in recent years. However, colistin resistance in K.pneumoniae began to increase which points out an emerging threat in the treatment of healthcare related infections. PhoP/PhoQ and PmrA/PmrB are the main systems responsible for modification of LPS layer. Changes in these two component regulatory systems cause colistin resistance. MgrB gene, which encodes the key regulatory protein of PhoP/PhoQ system, has the major role in the colistin resistance. Insertional inactivation or mutations in MgrB gene are highly associated with colistin resistance. In this study; our aim is to understand ongoing emergence of colistin resistance among K. pneumoniae strains by analysing the molecular mechanisms of colistin resistance and comparing the demographic risk factors, clinical futures and outcomes of the infections.A total of 32 patients with a isolation of colistin resistant K.pneumoniae from Ankara Başkent University Hospital, İstanbul Başkent University Hospital and Koşuyolu State Hospital were included to the study. Inactivation of MgrB gene by transposons and mutations in wild type MgrB gene were studied by PCR amplification followed by Sanger sequencing and products were identified by NCBI Blast tool and CLC Genomics Workbench v.4.9 software (CLC Bio, Aarhus, Denmark). Also, the expression levels of PhoQ and PmrK genes in colistin resistant isolates were analysed by quantitative real time PCR. The clonal analysis of the strains were done by rep-PCR using Diversilab system (bioMérieux, France).The univariate analysis of the clinical and molecular data were done by STATA 11 (Texas, USA)Insertional inactivation of MgrB gene was found in 26 out of 32 isolates. MgrB gene was distrupted by different insertion sequences (IS) classified as IS5 like, IS1 like, IS903 like and IS903B. Wild type MgrB was seen in 5 isolates. We detected nonsilent and point mutations in all of 5 isolates carrying wild type MgrB.There was no significant overexpression in PhoQ and PmrK genes. Our clonal analysis revealed that there were two major clones both containing samples from different centres with >95% similarity. Relatively younger age and staying in intensive care unit were found to be associated with IS related colistin resistance (P<.005). The mean duration of the colistin therapy in IS positive group was longer than the IS negative group (19 versus 7 days, p=.231). We report the first findings on the molecular and clinical epidemiology of colistin resistance among K.pneumoniae. The results of the study show that disruption of MgrB gene by transposons is the key mechanism for colistin resistance. Long term stay in intensive care unit, and younger age were major host risk factors that increase the risk of infection by a K.pneumoniae strain carrying IS in its MgrB gene. Prolonged colistin therapy might have an affect on IS related colistin resistance. Demonstration of the horizontal gene transfer between colistin resistant strains highlights the emergence of colistin resistance as the public health problem of the world.