Adaptation of acinetobacter baumannii to colistin exposure: In vivo and in vitro experience

Abstract

Acinetobacter baumannii (A.baumannii) ciddi enfeksiyonlara ve yüksek ölüm oranlarına neden olan patojenlerden biridir. Çoklu antibiyotik dirençli ve kolistin dirençli A.baumannii dünyada özellikle hastanelerde hızla yayılmaktadır. A.baumannii'de kolistin direncine neden olan 2 farklı mekanizma vardır: lpx genlerinde meydana gelen mutasyonlar ve pmrCAB operonunda meydana gelen nokta mutasyonları. İki mekanizma da hücre duvarının yapısında değişimlere neden olarak kolistinin bağlanmasını engellemektedir. Ancak tetikleyici faktörler ve colistin direncinin evrimsel mekanizmaları hala açıklığa kavuşmamıştır. Biz bu çalışmada kolistin kullanımına bağlı kolistin direnci gelişimini laboratuvar ortamında taklit ederek, direncin ilerlemesini takip etmeyi ve in vitro elde edilen sonuçları hastada in vivo gelişen direnç ile karşılaştırmayı hedefledik.VKV Amerikan Hastanesi (İstanbul) yoğun bakım ünitesinde Şubat – Mart 2016 döneminde yatan 35 yaşında kadın bir hasta çalışmaya dâhil edildi. Toplam dört kolistin duyarlı ve bir kolistin dirençli izolat toplandı. Hastanın klinik verileri ve tedavi sonuçları kaydedildi. Kolistin maruziyetine bağlı kolistin direnci gelişiminin taklidi için duyarlı izolatların 1 mg/L kolistin varlığında günlük seri pasajları yapıldı. Nesillerin minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile ölçüldü. Kolistin dirençli klinik izolat ve in vitro deneylerden belirli nesiller moleküler analizler için seçildi. pmrCAB operonu, lpxA, lpxC ve lpxD genleri sekanslandı. pmrC, pmrA, and pmrB genlerinin ekspresyonları qRT-PCR ile tespit edildi. Hastanın verileri ve moleküler testlerin sonuçları karşılaştırıldı.pmrA, pmrB ve pmrC genlerinin ekspresyonu kolistin dirençli klinik izolatta kolistin duyarlıya göre sırasıyla 1.6, 1.74 ve 1.72 kat fazla bulundu. Kolistin direnci hastada kolistin tedavisinin 25. günü tespit edildi. Dört duyarlı örneğin 38 seri pasajında, ilk pasajdan sonra kolistin MİK değerleri sınır değeri olan 2 mg/L'nin üzerindeydi. Deneyin 26. jenerasyonunda bütün izolatların pmrC ekspresyonu en yüksek değerine ulaştı (2.11-; 29.65 kat). Aynı jenerasyonda dört izolatın ikisinde pmrA (1.97 ve 8.54 kat) ve pmrB (2.31 ve 11.24 kat) ekspresyonları en yüksek değerlerine ulaştı. Ayrıca pmrA, pmrB, pmrC, lpxA, lpxC ve lpxD genlerinde çok sayıda insersiyon ttespit edildi.Sonuç olarak, pmrC, pmrA ve pmrB deki ekspresyon artışı ile birlikte pmrA, pmrB, pmrC ve lpx genlerinde meydana gelen mutasyonlar kolistin direnci gelişimine katkı sağlamaktadır. En yüksek pmrCAB ekspresyonlarının maruziyetin üçüncü haftasında ve sonrasında görülmesi ile kolistin-dirençli örneğin klinikte kolistin tedavinin 25. günü izole edilmesi bize A.baumannii'de kolistin direnci gelişimi için uzun dönem tedavi gerekliliğini gösterdi. Kolistin ile tedavi süresi ve kolistin direncinde önemli faktörler olarak bulundu. Bunlara göre, kolistin tedavisi sırasında kolistin kullanım süresi ve kombine tedavi seçenekleri göz önüne alınmalıdır.

Acinetobacter baumannii (A.baumannii) is one of the emerging pathogens which causes severe infections with high mortality. Multidrug-resistant (MDR) and colistin-resistant A.baumannii spread worldwide especially in healthcare centers. A.baumannii has two genetic mechanisms of colistin resistance: Complete loss of LPS as a result of mutations in lpx genes and point mutations in pmrCAB operon. Both mechanisms cause structural changes and eventually prevent colistin binding to cell wall. However, triggering factors and evolutionary mechanisms of colistin resistance are still not clearly understood. In this study, we aimed to mimic induction of colistin resistance by colistin exposure, follow-up the progression of resistance and compare in vitro results with in vivo resistance identified in an isolate from a patient. A 35-years old female patient admitted in VKV American Hospital (Istanbul) intensive care unit between February and March 2016 was chosen for the study. A total of four colistin susceptible and one colistin resistant A.baumannii isolates were collected. Patient's clinical data and outcome were recorded. Daily serial passages of susceptible isolates in presence of colistin at 1 mg/L concentration were performed to mimic development of colistin resistance in vitro by colistin exposure. Minimum inhibitory concentrations (MICs) were measured by broth microdilution. The colistin-resistant isolate and certain generations of in vitro experiment were chosen for molecular analyses. The pmrCAB complete operon and lpxA, lpxC, and lpxD genes were sequenced. The expression levels of pmrC, pmrA, and pmrB were studied by qRT-PCR. The patient's data and the results of molecular tests were compared. The pmrA, pmrB and pmrC genes were 1.6, 1.74 and 1.72 times overexpressed in colistin resistant clinical isolate than susceptible one. Colistin resistance was identified in the patient at 25th day of the colistin therapy. In 38 serial passages of four susceptible isolates, colistin MIC values were above breakpoint level of 2 mg/L after first passage. At the 26th generation of experiment, pmrC expressions of all isolates reached to a peak level (2.11; 29.65-fold). Moreover, in 2 of the four isolates pmrA (1.97 and 8.54-fold) and pmrB (2.31 and 11.24-fold) expressions were at the highest level in the same generation. We also detected multiple insertions in pmrA, pmrB, pmrC, lpxA, lpxC and lpxD genes.In conclusion, upregulation of pmrC, pmrA, and pmrB in combination with insertions in these genes and lpx genes may trigger development of colistin resistance. The highest pmrCAB expressions after 26th day of exposure and isolation of resistant strain from the patient at 25th day of colistin therapy suggested us that long term therapy is required for development of colistin resistance in A.baumannii. Therefore, duration of colistin use and combined therapy options should be considered and controlled properly during colistin therapy.