Virüslerin moleküler hibritleme tekniği ile belirtiminde tütün mozaik virüsü modeli

Abstract

V. ÖZET Nükleik asit (moleküler ) hibritleme tekniğinin kullanılarak, virüslerin erken tanı sisteminin oturtulması için yapılan bu çalışmada, model olarak üretimi kolay olan ve insanlara karşı patojenik olmayan tütün mozaik (TMV) virüsü alınmıştır. Virüs partikülleri ve saflaştırılan nükleik asitleri ısı, formamit, formaldehit ve deterjan içeren tampon varlığında denatürlenerek, hibrit oluşturma duyarlılığı arttırılmaya çalışılmıştır. Denatürlenmelerinden sonra, nokta emdirim (dot blot) aleti yardımıyla naylon membrana aktarılan örnekler, UV ışık ile membrana sabitlenmişlerdir. tf^P(ATP) ile işaretlenmiş 22 nükleotitlik sentetik prob ile hibritlenmeye sokulan örneklerde, formaldehit ile yapılan denatürlemeler sonucu duyarlılık sınırı, TMV partiküllerinde 90pg, RNA örneklerinde ise 8. 6pg olarak belirlenmiştir. Hastalıklı maydanoz bitkilerinin de aynı sistemle taranmasıyla, TMV'nün varlığı başarı ile belirlenmiştir. 56

VI. SUMMARY The aim of this work was to develop sensitive detection technique for viruses. In this study, tobacco mosaic virus (TMV) which can be prepared easily and is nonpathogenic for human was chosen as a virus model. In order to increase hybridization sensivity, different denaturants (heat, formamide, formaldehyde and detergent) were used to denature samples of virus particles and genomic RNA. TMV and genomic RNA extracted from tobacco leaves and they were applied to nylon filter membrane through dot blot apparatus under vacuum and fixed to membrane by UV light. Following the fixation of samples to membrane, they were allowed to hybridize with a radioactively labelled synthetic oligonucleotide probe. The hybrids were detected by autoradi ography. The detection limits were lowered to 90pg of TMV and 8.6pg TMV RNA when 15% formaldehyde used for denaturation. 57