Elongasyon faktörü 2 (EF-2) ve protein sentezi sonrası modifikasyonlar-otokatalitik biçimde gerçekleşen ADP-ribozillenme üzerine bir çalışma

Abstract

5.0ZET Değişik ortam koşullarının (serumsuz ortam, konfluent durum ve ısının (42 C)) EF-2 nin endojen ADP-ribozillenmesi üzerinde etkili olduğunun anlaşılmasıyla bunun hangi aşamada olabileceği belirlenmeye çalışıldı. Ortam koşullarına bağımlı olarak EF- 2'nin ADP-ribozillenmesindeki değişikliklerin, EF-2 miktarındaki değişiklikten kaynaklanmış, dolayısıyla bu koşulların gen ekspresyonu aşamasını etkilemiş olabileceği düşünülerek, konfluent durum, ısı şoku ve serumsuz ortamın EF-2 geninin ekspresyonu ile olası ilişkisine bakıldı. Bu amaçla kontrol hücre, konfluent duruma getirilmiş hücre, serumsuz ortamda tutulmuş hücre ve 42°Cta tutulmuş hücre örneklerinden RNA elde edilerek EF-2'ye özgün bir radyoaktif `prob` aracılığıyla moleküler hibritleme sistemiyle incelendiğinde EF-2 mRNA'sı miktarında çevre koşullarına bağlı bir değişme görülmedi. Bu bulgu, değişik ortam koşullarının gen ekspresyonundan sonraki düzenlemelerde etkili olabileceğini sezindirdi. Ayrıca transkripsiyon inhibitörü aktinomisin D'nin ya da protein sentezi inhibitörü sikloheksimidin kültür ortamına eklenmesinin hücrelerden hazırlanan özüt kesimlerinde ısı şokuna bağımlı olarak EF-2 ADP-ribozillenmesinde gözlenen artışı etkilemediği görüldü. Bunun yanısıra. sikloheksimit ile yapılan deney EF-2'nin hücre içinde hızlı bir dönüşüme tabi olduğunu gösterdi. Bu bulguların ışığında özütlerde ADP- ribozillenme değerlerindeki değişikliklerin EF-2'nin hücre içinde geçirdiği ADP-ribozil- lenmeyi yansıttığı görüşüne varıldı. Çalışmanın ikinci bölümünde EF-2'nin endojen ADP-ribozillenmesi için uygun Ca. Mg2+, NAD ve EF-2 derişimleri ile tepkime süresi belirlendi. Son bölümde ADP-ribozillenme reaksiyonu bir gösterge olarak alınarak serumda eADP-ribozillenen bir proteinin varlığı saptandı. eADP-ribozillenmede rol oynayan akseptör proteinleri tanımlamak amacıyla ' `P-NAD varlığında yürütülen reaksiyondan sonra SDS- Poliakrilamit Gel Elektroforezine ve otoradvocram işlemine tabi tutulan serum proteinlerinden yalnızca bir tanesinin otoradyogramda sinyal verdiği belirlendi. Yaklaşık 97 kDna karşılık geldiği belirlenen bu protein kısmen saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi sonucu bu proteinin ADP-riboziltransferaz etkinliği ve ADP-Riboz akseptcr özelliğini taşıdığı, yani ADP-ribozillenmenin otokatalitik olarak bu protein üzerinde gerçekleştiği belirlendi. Çalışmada aynı zamanda serum proteininin eADP-ribozillenme etkinliği için (Auygun koşulların belirlenmesine çalışıldı. Reaksiyonun en etkin biçimde yürümesi için kalsiyumun (8 mM) gerekli olduğu, NAD için Km değerinin 105 uM olduğu, indirgeyici ayıraçların arttırıcı etkisi olduğu bulundu. Aynı etkinliğin varlığı belirli farklılıklara karcın değişik türlerde de gösterildi. Çeşitli hasta serumları incelendiğinde bu etkinliğin tümör oluşumlu hastalarda arttığı gözlendi. 65

6.SUMMARY Since the extent of ADP-ribosylation of EF-2 is affected in response to different environmental conditions such as a serum deficiency, confluency and heat shock (42 C), determining the stage of gene expression at which this is regulated is of interest. A possible relationship between the expression of the EF-2 gene and the above mentioned environmental conditions was looked for, assuming that the changes observed in the ADP-ribosylation of EF-2 might be due to changes in the amount of EF-2. When RNA obtained from control cells and cells from the experimental group were analyzed by molecular hybridization using a specific radioactive probe, it was observed that the amount of EF-2 mRNA did not vary in response to enviromental conditions. This finding implied a possible regulation at stages after gene expression. Actinomycin D or cycloheximide, specific inhibitors of transcription and translation respectively, were added to the incubation medium and ADP-ribosylation of EF-2 was measured in extracts prepared from these cells. The addition of these inhibitors to the incubation medium did not affect the increase in ADP-ribosylation of EF-2 brought about by heat shock. In addition, the experiments carried out with cycloheximide indicated to a high turnover rate of EF-2 in the cell. Thus, it was concluded that the observed changes in ADP- ribosylation of extracts reflected the changes in the ADP-ribosylation of EF-2 in whole cells. 2+ 2+ In the second part of this work, the optimum concentrations of Ca, Mg, NAD and EF-2 and the reaction times for endogenous ADP-ribosylation were deter mined. Finally, a serum protein which was eADP-ribosylated was identified by using the ADP-ribosylation reaction as a criterium. In order to determine the acceptor proteins ^2 involved in eADP- ribosyiation, serum proteins were incubated in the prsence of ~ P- NAD and separated on an SDS-polyacrylamide gel. The autoradiogram showed that only one protein with a molecular weight of 97 kD. was labelled with - P. This protein was partially purified and was shown to contain ADP-ribosyltransferase activity and behave as an ADP-ribose acceptor; in other words, ADP-ribosylation in this protein took place autocatalytically. 66A further attempt was to determine the optimum conditions for eADP-ribosyla- tion of this protein. Ca (8 mM) was required, reducing agents had a stimulatory effect and the Km for NAD was 105 nM in this reaction. Other species were also shown to contain the same activity, although with some differences. Sera from patient with various disorders were analyzed and an increase in this activity was observed in patients with tumors. 67