Tavşan embryolarının kazanılması ve kültüre edilmelerinden sonra transferleri üzerinde araştırmalar

Abstract

- 98 - 6. ÖZET Araştırma, tavşanlarda süperovulasyon, embryoların ka¬ zanılması, kazanılan embryoların 96 saat süre ile kültürleri ve kültür aşamasından sonra gelişme gösteren embryoların transfer¬ leri olmak üzere 4 aşamada gerçekleştirildi. Bu çalışma için 60'ı verici 30'u alıcı olmak üzere top¬ lam 90 dişi, vericilerin tohumlanması için de 4 adet erkek damızlık tavşan kullanıldı. Süperovulasyon için PMSG iki farklı yöntemde, toplam aynı dozda uygulandı. ilk uygulama grubunda 30 tavşana 225 IU PMSG tek enjeksiyonla verilirken, ikinci grupta aynı doz PMSG üç eşit kısıma(75 IU) bölünerek 24 saat ara ile uygulandı. Vericiler tek enjeksiyon yönteminde PMSG uygulamasından 72 saat, üç enjeksiyon grubunda ise son PMSG verilişinden 24 saat sonra iv. olarak hCG enjeksiyonu ve tohumlama işlemine tabi tutuldular. Tohumlamadan 24 saat sonra her iki grupta bulunan vericiler, ovaryumlardaki oluşumların belirlenmesi ve embryo kazanılması amacıyla operasyona alındılar. Operasyonlarda, tek enjeksiyon grubundaki tavşanların ovaryumlarında ortalama 25.96 +_ 4,96 adet oluşum(follikül + ovulasyon odağı) saptandı. Bunlardan ortalama 8*43 +_ 2»29 tanesi patlamamış follikül, 17»53 +. 4*99 tanesi ise ovulasyon odağı idi. Bu grupta ovulasyon oranı %67.43 olarak belirlendi, üç enjeksiyon grubunda ise bu değerler 28.46 +_ 5*64 adet toplam oluşum, 12.96 +_ 3*43 adet patlamamış follikül, 15*5 +. 3.59 adet ovulasyon odağı şeklinde idi. Ovulasyon oranı da %54.5 olarak saptandı. Yapılan ovidukt yıkamaları sonucunda, tek enjeksiyon grubunda hayvan başına ortalama 14.46 +_ 4 «64 adet yumurta hücresi kazanıldı. Kazanılan hücrelerden ortalama 2.6 +_ 1,33 tanesi ovum, 4.9 +_ 2.74 tanesi zigot, 6«73 i 2,61 tanesi 2 blastomerli, 0,2 i 0.10 tanesi 4 blastoroerli embryo olarak belirlendi, öç enjeksiyon grubunda ise ortalama 14.3 +_ 3,76 adet hücre kazanılırken, bu hücrelerden 2.1 ±_ 1,26 tanesi ovum, 3.7 ± 1.75 tanesi zigot,- 99 - 8.2 +^ 3.21 tanesi 2 blastomerli, 0»23 +_ 0.34 tanesi de 4 blastomerli embryo olarak tesbit edildi* Hücrelerin ovulasyon odaklarına göre kazanılma oranları tek enjeksiyon yönteminde %82.8, üç enjeksiyon grubunda %92.2 olarak belirlenirken, kazanılan hücrelerin fertilizasyon oranları ise tek enjeksiyon grubunda %82.02, üç enjeksiyon grubunda %84.84 olarak saptandı. Elde edilen veriler incelendiğinde, üç enjeksiyon yöneminin, hücre kazanma (P< 0.001) ve kazanılan hücrelerin bulunması gereken 2 blastomerli gelişim devresinde yoğunlaşma oranları açısından (P< 0.005) tek enjeksiyon yöntemine göre üstün olduğu belirlenirken, tek enjeksiyon yönteminin ise, ovaryumlarda bulunan patlamamış follikül sayıları (P<0.05) ve ovulasyon oranları (P<0.001) açısından üç enjeksiyon yöntemine karşı daha iyi sonuç verdiği saptandı. Her iki grupta elde edilen sağlıklı embryolar 37°C'lık ve %5 C02'ii ortamda, TCM 199 + % 20 BB, TCM 199 + %1.5 BSA ve PBI + %20 88 mediumlarında, 24 saatlik periodlarda toplam 96 saatlik bir süre için in vitro olarak kültüre edildiler. Çalışma¬ nın başlangıcında ilk 24 saatlik süre için zigot ve 2 blastomerli embryolar ayrı ayrı kültüre edildiler. Buna göre zigotlar, TCM 199 + %20 88 mediumunda %72, TCM 199 + %1.5 BSA'da %72.1 ve PBI + %20 SS mediumunda %65 oranında gelişirken, 2 blastomerli embryolar aynı şartlarda %75.69; %65.22 ve %65.84 oranında gelişim gösterdiler. Bu sonuçlara göre TCM 199 + %20 SS mediumunda elde edilen gelişimin, diğer mediumlarda elde edilen gelişimlere karşı istatistik! yönden bir önem taşımasa da, daha üstün olarak gerçekleştiği belirlendi. Zigot ve 2 blastomerli konumda bulunan embryoların toplam gelişimleri TCM 199 + %20 88 mediumunda %75, TCM 199 + %1.5 BSA mediumunda %67.95 ve PBI + %20 SS mediumunda ise %65.56 olarak belirlendi. TCM 199 + %20 SS me- diumunun diğerlerine göre üstün bir gelişme sağlamasına karşın, bunlardan sadece PBI + %20 88 mediumuna olan üstünlüğün istatis- tiki yönden önem taşıdığı belirlendi(P< 0.05). 24 saatten sonraki aşamalarda embryoların gelişimleri TCM 199 + %20 88 medimu- 100 - içerisinde 48 saat sonunda %76.41, 72 saat sonunda %68.38 ve 96 saat sonunda %58.4; TCM 199 + %1.5 BSA mediumunda aynı süreler için sırasıyla %67.75, %66.67 ve %40.58; PBI + %20 SS mediumunda ise %68.65, %66.23 ve %35.29 oranında elde edildi. Vericilerin tohumlanmasından 24 saat sonra kazanılan ve 96 saatlik kültür süresi sonunda gelişme gösteren embryoların oranları ise TCM 199 + %20 SS mediumunda %21.31, TCM 199 + %1.5 BSA mediumunda %11.96 ve PBI + %20 SS mediumunda ise %10.00 olarak belirlendi. Bu sonuçlara göre 24. saatten 72. saatin sonuna kadar TCM 199 + %20 SS mediumunda elde edilen embryoların gelişim oranları, diğerlerine göre üstün görünüp, istatistiki bir önem taşımazken, 72. saatin sonunda gelişim göstererek son 24 saatlik süre için tekrar kültüre edilen, TCM 199 + %20 SS mediumundaki embryoların gelişim oranları bu süre sonunda, TCM 199 + %1.5 BSA (P< 0.05) ve PBI + %20 SS (P< 0.01) mediumlarındaki gelişim oranlarına göre istatistiki yönden üstün bulundu, in vitro kültü¬ rün başlangıcından sonuna kadar TCM 199 + %20 SS medimunda embr- yolarda kaydedilen total gelişimin, TCM 199 + %1.5 BSA (P< 0.01) ve PBI + %20 SS mediumlarında(P< 0.005) elde edilen gelişimlere oranla oldukça üstün olduğu saptandı. 96 saat sonucunda TCM 199 + %20 SS mediumunda gelişme gösteren toplam 23 embryo 2 alıcıya, TCM 199 + %1.5 BSA mediumunda gelişen 18 eınbryo 2 alıcıya ve PBI + %20 SS mediumunda gelişen 14 embryo i alıcıya transfer edildi. Ancak yapılan kontrollarda transferlerin hiçbirinde gebelik oluşmadığı belirlendi.

- 101 - 7. SUMMARY This study was carried out in 4 steps; superovulation of rabbits, recovery of embryos, culture of the recovered embryos for 96 h and transfer of the developed ertıbryos to the recipients. Total 90 female rabbits were used in the study, 60 were donors and 30 were recipients, also 4 males were used for mating. Superovulation is provided by injecting egual doses of PMSG in two different methods. in the first group each of the 30 donors were superovulated by a single injection of 225 IU PMSG. in the second group same döşe of PMSG was divided into 3 portions(75 IU) and injected to the other 30 donors with 24 h intervals. Ali of the donors were treated with 150 IU hCG and roated after 72 h from the PMSG injection in the first group, and 24 h after the last injection of PMSG in the second group. 24 h after mating donors of both groups were operated in order to detect the structural findings on the ovaries and to recover the ertıbryoe. At the end of operations, in the first and second group, 25.96 +_ 4.95 and 28.46 ± 5*64 respectively, total structural findings ( follicle + ovulation point) were observed. in the first group 8.43 +_ 2,29 unovulated follicles and 17.53 ±_ 4.99 ovulation points were noted. However, the values for the second group were 12.96 +_ 3.43 and 15.5 i 3.59 raspectively. The ovulation rate for both the group was 67.43% and 54.5% respectively. From the oviduct flushings of first group,on an average 14.46 +_ 4.64 fertilized & unfertilized ova per animal vere recovered. Out of the total recovered ova, 2.6 +_ 1.33 were unfertilized ova, 4.9 +_ 2.74 were zygotes, 6.73 i 2.61 were 2 celi stage and 0.2 +_ 0.10 vere 4 celi stage embryos. in the second group, 14.3 ^ 3.76 ova were recovered. Out of the total in this group, 2.1 +_ 1.26 were ova, 3.7 i 1.75 were- 102 - zygotes, 8.2 +_ 3,21 were 2 celi stage and 0*23 l 0.34 were 4 celi stage embryos. The recovery rate of ova relating to their ovulation points were 82.8% in the first group and 92.2% in the second group. The fertilization rate of the recovered ova were 82.02% and 84.84% respectively. From the flushing it was observed that the recovery rate (P<0.001) and number of two celi stage embryos were significantly higher (P<0.005) in the second group than the first group. Hovever, the number of unovulated follicles (P<0.05) and ovulations rate (P< 0.001) were higher in the first group. Healty embryos collected from each group were cultured at 37°C and 5% C02 containing atmosphere in TCM 199 + 20% CS, TCM 199 + 1.5% BSA and PBI + 20% CS culture media for 96 h. For the first 24 h the zygotes and 2 celi stage embryos were cultured separately. The developmental rate for zygotes was 72% in TCM 199 + 20% CS, 72.11% in TCM 199 + 1.5% BSA and 65% in PBI + 20% CS medium. However, it was 75.69%, 65.22% and 65.84%, respectively, for 2 celi stage embryos in the these culture media. From the results it was obvious that although statistically there was no difference among three culture media, but, TCM 199 + 20% CS proved to be better than the other two media. The total development rate for embryos (zygot + 2 celi stage embryos) was 75% for TCM 199 + 20% CS, 67.95% for TCM 199 + 1.5 BSA and 65.56% for PBI + 20% CS culture media. TCM 199 + 20% CS differed significantly (P<0.05) than PBI + 20% CS culture medium, but, TCM 199 + 20% CS differed non significantly than TCM 199 + 1.5% BSA. The differance betveen TCM 199 + 1.5% BSA and PBI + 20% CS was also non significant. The rate development for embryos was 76.41%, 68.38% and 58.4% in TCM 199 + 20% CS at the end of 48, 72 and 96 hours of culture respectively. Whereas it was 67.75%, 66.67% and 40.58% in TCM 199 1.5% BSA ; and 68.65%, 66.23% and 35.29% in PBI + 20% CS respectively. Embryos collected 24 h after insemination of donors when cultured for 96 hours, they developed- 103 - 21.31% in TCM 199 + 20% CS, 11.96% in TCM 199 + 1.5% BSA and 10.00% in PBI + 20% CS culture medium. Although upto 72 hours of culture there was no significant difference among the three culture ı&edia, but, f rom 72 hours to 96 hours of culture TCM 199 + %20 CS differed significantly than PBI + 20% CS (P<0.01). The total developmental rate of embryos (zygotes ; 2 celi stage embryos) from the beginning upto 96 hours of culture in the TCM 199 + 20% CS culture medium differed significantly than TCM 199 + 1.5% BSA (P<0.01) and PBI + 20% CS (P<0.005). At the end of 96 hours of culture, 23 embryos from TCM 199 + 20% CS, 18 embryos f rom TCM 199 + 1.5% BSA and 14 eıttbryos from PBI + 20% CS, were collected and were transferred into 2, 2 and l recipient respectively. The transfers vere not resulted in pregnancy.