İnfeksiyöz Bronşitis Virusu (IBV)`nun üç patogen suşu ile infekte edilen civcivlerdeki nefrolojik bulguların histopatolojik karşılaştırılması

Abstract

6. ÖZET İki bölüm halinde yapılan çalışmada 181 adet 1 günlük WL SPF civciv kullanıldı Her iki bölümde de inokulasyon gününe (14. güne) kadar birarada bakım ve beslenmeleri yapılan civcivlerden, birinci bölümde 65 adet civcivden 5 adeti ve ikinci bölümde 1 16 adet civcivden 13 adeti ilk iki hafta içinde ön incelemeleri yapılmak üzere otopsiye alındı. Çalışmanın 14. gününe (inokulasyon günü) gelindiğinde, geriye kalan civcivlerle deney ve kontrol grupları oluşturulması işlemine geçildi. Bu amaçla birinci bölümde inokulasyon öncesi 60 adet civcivin 20 adeti kontrol grubu olarak ayrıldı. Kalan 40 adet civcive EED5010-9/l mi olan liyofilize M41 susu steril PBS ile uygun miktarda sulandırıldıktan sonra bir damlalık yardımı ile 3 damla x 0.05 mi. dozda göze damlatma (konjunktival) şeklinde eprüve edildi. İkinci bölümde ise 40'ar adetlik 2 deney grubu ve 20 adetlik bir kontrol grubu olmak üzere ayınldı. Aynı gün, deney gruplarının birine En>50 1G`6 1 1 mi. olan liyofilize Holte susu ve diğerine EID50 = 105-3/ 1 mi. olan liyofilize Avustralya T susu steril PBS ile uygun miktarda sulandırıldıktan sonra bir damlalık yardımı ile 3 damla x 0.05 mi. dozda göze damlatma (konjunktival) şeklinde eprüve edildi. Her iki bölümde de kontrol gruplarına enfekte olmamış sulandırıcı aynı dozda ve yolla eprüve edildi. Çalışmanın her iki bölümünde de yem ve suda kısıtlama yapılmaksızın hayvanlar ad libitum olarak beslendi. Çalışmanın her iki bölümünde de 14. günde yapılan eprüvasyondan sonraki (P.I.) 1, 2., 5., 7., 10., 12., 14., 17., 19., 21., 24., 26., 28., 31., 33., 35., 38., 40., 42. günlerde her defasında deney gruplarının her birinden 2 adet ve kontrol gruplarından 1 adet tavuğun otopsileri yapıldı. Tanımları yapılarak ağırlıkları kaydedilen hayvanlar boyunları kesilerek öldürüldü. Sistemik olarak otopsileri yapılan her hayvanın msîroskopik bulguları kaydedilerek, resimleri çekildi. Otopsiler sırasında alman kan örntk'erinden elde edilen serumlar etiketli ve kapaklı tüplere alınarak, serolojik muayeneleri yapıldı. Otopsiler sırasında alman başta böbreklerden olmak üzere akciğerlerden ve trakeanın üst bölümlerinden alınan doku örnekleri makroskopik incelemeleri yapıldıktan sonra, bilinen histolojik yöntemlerle preparasyon işlemleri tamamlanan kesitlerin tümüne HE (Hematoksilen-Eozin) boyaması ve gerekli görülenlere P.A.S. (Periodic Acid Schiflf), PA- SM (Periodic acid-Silver methanamine), Masson's trichrome ve Gomori's reticulum boyamaları uygulandı. İşık miroskobu ile yapılan incelemelerde; böbreklerde tubuler değişiklikler ve inflamasyon, akciğerler ve trakeada infeksiyöz bronsitis'in devamlı lezyonlannm varlığına bakılarak, bulgular 1 haftalık periyodlar halinde kaydedildi ve resimleri çekildi. IBV'nin üç patojen susunun kullanıldığı çalışmamızda infeksiyöz bronşitisin tipik solunum sistemi semptomları M 41 suş grubunun % 70-80'inde şiddetli fazı P.I 2- 7 günlerde izlenirken, Holte suş grubunun % 50'si ve Avustralya T suş grubunun % 40- 50'sinde P.I. 3-5.günlerde izlendi. Tüm deney gruplarında P.I. 8. günde kaybolan bu semptomlar, ancak gece hayvanların sakin oldukları dönemde tespit edildi. Otopsilerde ilk olarak P.I. 2-3. günlerde tespit edilen solunum sistemi makroskopik lezyonlannm şiddetleri deney grupları arasında farklı olmakla birlikte, P.I. 5-1 5. günler arasında yaygın olarak izlendi. Trakealann özellikle üst 1/4 'ünde mukozalann ödemk65 kataral görünümü ile peteşiyel kanama odaklarının varlığı, hava keselerindekı hafif matlaşma, akciğerlerin ödemli ve konjesyone görünümü ile karakterize pnöymonik tablonun oluşturduğu bu lezyonlar, M 41 suş grubunda belirgin ve yaygın, Holte ve Avustralya T suş gruplarında orta düzeyde ve yaygın olarak izlendi. Üriner sistem makroskopik lezyonlan olarak P.I. l-2.haftalar boyunca Avustralya T suş grubunda daha belirgin olmak üzere, Holte ve daha hafif olarak da M 41 suş grubunda böbreklerde ödem, konjesyon ve bulanık-mat dejeneratif görüntü ile karakterize değişiklikler izlendi. Bu dönemde üreterlerde mukozaların kalmlaştığı, ödemli ve beyaz sulu içerikle dolu olduğu tespit edildi. P.I. 14-17.günlerde Avustralya T suş grubunda bazı hayvanlarda, ancak çok dikkatli bakıldığında farkedilebilen bu görüntüye, mikroskopide izlenen, yoğun mononuklear hücre infiltrasyon alanlarının neden olduğuna karar verildi. Histopatolojik bulguların gelişim zamanlan, şiddetleri ve görüntüleri yönünden suş grupları arasında önemli farklılıklar gözlendi. M 41 susunun akut dönemde şiddetli solunum sistemi lezyonlan yanında, tubul epitellerinde yaygın dejeneratif ve nekrotik değişikliklerle karakterize yumuşak böbrek lezyonlan oluşturduğu izlendi. Holte ve Avustralya T suşlannm ise akut dönemde orta şiddette solunum sistemi lezyonlan yanında, böbreklerde hem tubuler yapıda, hem de interstisyel dokuda yaygın lezyonlara neden olduğu tespit edildi. Bronşitis lezyonlannm, başlangıçta trakeitis kadar şiddetli ve yaygın olmadığı, ancak trakeitis ile aynı zamanda oluştuğu izlendi. Akut ve subakut dönemlerde ödem, hiperemi ve çoğunluğu lenfohistiyositer hücrelerden oluşan, yoğun infiltrasyonlar sonucu trakea ve bronş mukozalannm yer yer 5-6 misli kalmlaştığı ve bazı bronşlarda bronkostenoz durumu tespit edildi. Bazı hava kapillarlannda yoğun yangısel hücre infiltrasyonu ile karakterize pnöymoni tablosu izlendi. Mikroskopik böbrek lezyonlannm şiddeti ve görübne oranı yönünden de suş grup'inwt arasında farklılıklar görüldü. Akut dönemin genel histopatolojisinde, tubuler epitellerde vakuolizasyon, granüler dejenerasyon ve tubuler epitellerin nekrozundan dökülmesine kadar uzanan değişiklikler ile karakterize nefrozis, en yoğun Avustralya T suş grubunda olmak üzere tüm suş gruplarında tespit edildi. întertubuler alanlarda ödem ve yoğun hücre infiltrasyonları ile karakterize interstisyel nefritis ise Avustralya T suş grubunda şiddetli ve Holte suş grubunda hafif düzeyde izlenirken, M 41 suş grubundaki sadece birkaç hayvanda interstisyel değişiklikler gözlendi. Bu lezyonlar daha çok medullada olmak üzere hem kortekste hem de medullada görüldü. İnterstisyel yangısel hücre infiltrasyonlarının özellikle glomeruluslar çevresindeki alanlarda ve korteks-medulla geçiş bölgesindeki büyük glomeruluslar çevresinde başladığı ve yoğunlaştığı tespit edildi. Tubul epitellerinde şiddetli dejeneratif ve tek hücre veya tüm tubul nekrozu şeklindeki nekrotik değişikliklerin birarada bulunduğu tubullerde, karekteristik özelliklerinin kaybolması sonucu bu değişikliklerin nefronun hangi bölümlerini kapsadığı tam olarak tespit edilemedi. Bu dejeneratif ve nekrotik değişikliklerin özellikle kortekste, interlobular ve intralobuler venler arasında, glomerulusların yer aldığı orta hat çevresindeki tubullerde yoğunlaştığı görüldü. Subakut dönemde tubuler epitellerde dejeneratif değişiklikler yanında erken rejenerasyonun göstergesi miloz ve mitotik figürler görüldü. Bu dönemde medullar intertubuler ve kortekste glomenıler kapsül çevresinde yine intertubuler alanlarda, infıltre66 bazı lenfositlerin antikor yapımı ile birlikle FAS (+) siloplazmik granüller tarzında Russel cisimciklerini taşıyan plazma hücrelerine dönüştükleri izlendi. Plazmositlerin görülme oranının interstisyal infiltrasyonlarla bağlantılı olarak arttığı izlendi, lnterstisyal nefritisin yok denecek kadar az izlendiği M 41 suş grubunda plazmositlere aynı oranda az rastlandı. Plazmositlerin sitoplazmalannda izlenen PAS (+) Russel cisimciklerinin, bazen çok sayıda küçük damlacıklar, bazılarında ise homojen ve koyu boyanan tek damlacık halinde oldukları görüldü. Kronik dönemde ise tubuler dejeneratif ve nekrotik değişikliklerin azalması yanında, tubuler yapılan bozarak yayılım gösteren mononuklear hücre infiltrasyonlannın varlığı izlendi. Akut dönemden itibaren, özellikle korteksin orta-alt kesimlerindeki büyük glomeruluslar çevresinde başlayan diffuz formdaki mononuklear hücre infiltrasyonlannın çevrelerinde 3. hafta sonlanna doğru başlayan retikulum formasyonu ile fokal alanlara dönüştüğü görüldü. Hücresel profilini genç lenfositlerin ve histiyositlerin oluşturduğu bu yapıların, normal histolojik yapıda germinal merkezler veya folliküllerin varhğı nedeniyle, lenfoid nodüller olarak adlandınlmasının uygun olduğu düşünüldü. Beyaz legornlann kullanıldığı çalışmamızda, Avustralya T suş grubunda da kronik interstisyal nefritisin aktif formda olduğu tespit edildi. P.I. 1. günden itibaren ödem, hiperemi ve yangısel hücre infiltrasyonlan ile karakterize ureteritis lezyonlan da üreter ve interrenal üreter kollan mukozalarında görülmeye başlandı. Ureteritis lezyonlanna en şiddetli olarak Avustralya T grubunda, Holte suş grubunda orta ve interstisyel nefhtis lezyonİannm yok denebilecek kadar az izlendiği ya da hiç görülmediği M 41 suş grubu hayvanlarda ise hafif düzeyde gözlendi. Çalışmamızda aynca IB nefritis lezyonlan dışında, bu lezyonların en şiddetli oluştuğu Avustralya T suş grubunda birkaç hayvanın glomerulus bowman kapsülü pariyetal yr^ağmda küboidal metaplazi izlendi.

67 7. SUMMARY In our study which we have carried out in two stages, we used 1 8 1 one day old WL SPF chicks. 5 of the 65 chicks which make up the first stage and 13 of the 1 16 chicks which make up the second stage of our study were maintained together until the day of inoculation (day 14) and thereafter, slaughtered and autopsied for prcnnoculatıon examinations which were made on the first two weeks. On the 14th day of our study, we proceeded to seperate the trial and the control groups with the remaining chicks. For this reason, 20 of the 60 chicks of the first stage were seperated before inoculation. Lyophilised M 41 strain which had an EID50 of 10-'/ 1 ml. was administered by the intraocular route by a dropper in the dose of 3 drops x 0.05 ml. to the remaining chicks. In the second stage, the chicks were seperated in order to comprise 2 trial groups, of each containing 40 chicks. On the same day, lyophilized Holte strain having an EID50 of 10`6/ 1 ml. and lyophilized Avustralian T strain having an EDD50 of 1053/ 1 ml.were administered by intraocular route in the dose of 3 drops x 0.05 ml. after dilution by adequate sterile PBS to one of the trial groups and the others respectively. Control groups received non-infected dilution solution in the same dose in both of the stages. In both stages of the study, the chicks were fed ad libitum (without any limitation on their feed and water consumption). In both stages of our study, 2 chicks from every trial group and 1 chick from the control group were sloughtered for post-mortem examination on the 1st, 2nd, 5th, 7th, 10th, 12th, 14nd, 17th, 19th, 21st, 24th, 26th, 28th, 31st, 33rd, 35th, 38th, 40th, and the 42nd days post inoculation. The chicks were slaughtered by simply incising their necks, after recording their weights. Each animal was autopsied systematically, gross findings were recorded and their photographs were taken. The blood samples which.erg* collected simultaneously with the slaughtering procedures were kept in labeled and covered iubes for serological examination. The collected tissue samples-mainly kidneys, lungs and upper l/4th of the tracheas were all stained with H.E. (Hematoxylene & Eosin) routinely and also P.A.S., P.A.S.M., Masson's trichrome and Gomori's reticulum stains were administered to samples which we found necessary. In the examination which were carried out under light microscope, evidences of tubular changes and inflammation in the kidneys and permanent lesions of IB. on the tracheas were detected, the findings were recorded and taken photographs in one week intervals. In this study which we have used the three pathogenic strains of 1BV, the severe phase of the typical respiratory system symptoms of 1BV on the 70-80% of the M 41 strain groups were observed on Ihe 2nJ -7th days of P.I. while this phase was observed on the 50% of the Holte and 40-50% of the Australian T strain groups on the 3rd-5Ul days of P.I. The symptoms which dissapearcd on the 8th day of P.I. in all experiment groups, was observed on the night periods which the animals were quite calm. Although the severity of the gross lesions of the respirator)' system which were diagnosed for the first time on 2nd-3ül days of P.I. were significantly different, it was possible to observe commonly between the 5th and 15ü) days. The lesions which were68 comprised the edema, catarrhal appearance and the presence of petechial bleeding on the mucasae of the upper 1/4* of the tracheas, the dull appearance of the air sacs, and the pneumonic picture were more obvious and extensive in the M 41 strain group while they were mild and extensive in the Holte and Australian T strain groups. As the gross lesions of the urinary system, being more evident in the Avustralian T strain, Holte strain and milder in the M 41 strain groups, changes characterised with ? dema, congestion and turbid-dull appearance were observed in the kidneys throughout the 1st and 2nd weeks of P.I. In this phase the mucosae were determined to be thickened and filled with an edematous and whitish exudate. On 14th- 1 7th days of P.I., in some chicks of Australian T strain group, the appearance which was only possible to be realized when examined thoroughly was determined to be caused by the dense mononuclear cell infiltrations which can be observed microscopically. Significant differences were observed in the period of development, severity and the appearance of the histopathological findings. It is also observed that M 41 strain caused severe lesions in the respiratory system and also slight lesions characterised with diffuse degenerative and necrotic changes in the tubular epithelium. In the case of Holte and Australian T strain groups, h was determined that these viruses caused mild lesions in the respiratory system and widespread lesions either in the tubular structures or in the interstitium. It was observed that the bronchitis lesions were not as severe and diffuse as tracheitis but they started simultaneously with tracheitis at the onset of the disease. On the acute and sub-acute phases, tracheal and bronchial mucosae were observed to be thickened 5-6 fold as a result of edema, hyperemia and diffuse infiltration, primarily composed of lympho- hystiocytary series cells, and bronchostenosis in some of the bronchi. And also, it was possible to see the pneumonial appearance characterised with dense inflammatory cell infiltration in some of the air capillaries. It was also possible to determine some significant differences between the strain groups in the severity and incidence of microscopical kidney lesions. In the general histopathology of the acut phase, vacuolisation in the tubular epithelium, nephrosis characterized with granular degeneration and changes from the necrosis of the tubular epithelium unlill their desquamation were determined in all strain groups, being more severe in Australian T strain groups. Although interstitial nephritis characterised with edema in the intertubular area and dense cell infiltrations was observed to be severe in the Avustralian T strain group and milder in Holte strain group, the interstitial changes were observed in only a few chicks of the M 41 strain group. These lesions were seen both in the medulla and the cortex, but more extensive in the medulla. It was determined that the inflammatory cell infiltrations started and focused primaryly around the large glomeruli in the cortico-medullar zone and in the areas around the glomeruli In the tubules which severe degenerative and necrosis of a single cell or the whole tubule were found together, it was not possible to determine which parts of the nephron was affected by these changes in the characteristical structure. These degenerative and necrotic changes were observed to be more dense between the intralobular and interlobular veins and in the median line which the glomeruli are situated.69 Jn the sub-acute pha.se, mitosis and mitotic figures as a sign of regeneration m the early phase along with the degenerative changes in the tubular epithelium were observed. In this phase, some of the lymphocytes in the medullary intertubular and glomerular capsules and also in the intertubular areas were observed to be transformed into plasma cells which contain Russel bodies in the shape of PAS (+) cytoplasmic granules, by antibody production. It was also concluded that the incidence of plasmocytes increased in association with interstitial infiltrations. In the M 41 strain group which interstitial nephritis was seen so rare to be as they were not seen the plasmocytes were also seen so rarely. The PAS(+) Russel bodies which were observed in the cytoplasm of the plasmocytes were sometimes in the shape of small droplets and sometimes densely stained, homogeneous single drops. In the chronical phase, the presence of mononuclear cell infiltrations which extend by destroying the tubular structures, along with the tubular degenerative and necrotic changes were observed. From the onset of the acute phase the cellular infiltration was observed to be transformed into reticulum formations and focal areas at about the 3rd week, especially in the glomeruli of the lower-medial parte of the cortex. Because of the presence of the germinal centers and the follicles in the normal histological appearance, these structures which were composed of immature lymphocytes and histiocytes were concluded to be termed as lymphoid nodules. In our study which white leghorns were used, the cronic interstitial nephritis in the Australian T group was also determined to be in the iactive form. From the 1st day of P.I. it was possible to observe the ureteritis lesions characterised with edema, hyperemiae and inflammatory cell infiltrations in the ureter and the interrenal uretary branches. Ureteritis lesions were determined to be most severe in the Australian T strain group while they were mild in Holte and slight interstitial nephritis to be termed as `not seen` in M 41 strain group. Apart from the IB. nephritir JeswSlis in our study, cuboidal metaplasie was observed in the parietal foil of the glomerulus-bowman capsule of a few animals of the Australian T strain group which these lesions occured severely.