Modeling of potato ADP-glucose pyrophosphorylase

Abstract

Bu tezde ADP-glukoz pirofosforilaz (AGPaz) enziminin doğal yapısını ve enzimin yapıtaşları arasındaki etkileşimlerde önemli rolü olan amino asitleri belirledik. AGPaz büyük (BY) ve küçük (KY) ikili yapıtaşlarından oluşur. KY'ı yakınlarda türdeş dörtlü yapı halinde kristalleştirildiği halde BY'nın ve doğal AGPaz enziminin yapısı henüz gösterilemedi. Bu çalışmada önce BY'ın yapısını benzeşim modellemesi yöntemini kullanarak modelledik. Daha sonra AGPaz için KY'ın türdeş dörtlü kristal yapısına dayanarak üç model öne sürdük. Yapıtaşları arasındaki altı adet ikili etkileşim çeşidi öne sürülen modellerin temsilleri olarak seçip çıkarıldı. Bu ikili etkileşimlerin moleküler dinamik simulasyonlarını gerçekleştirdik. Simulasyonlardan elde edilen yörüngeler moleküler mekanik Poissson-Boltzmann yüzey alan (MM-PBYA) metodu ile yapıtaşları arasındaki bağlanma enerjisinin hesaplanması ile analiz edildi. En uygun iki etkileşim çeşidi AGPaz' ın yapılandırılmasında kullanıldı. Yapıtaşları arasındaki etkileşimde kritik olan önemli-nokta amino asitleri moleküler mekanik genellenmiş doğuş yüzey alan metodu kullanılarak ve enerji dağılımlandırılması yöntemi uygulanarak belirlendi. Hesaplamalı veriden elde edilen amino asitlerin önemi deneysel olarak doğrulandı. Bu amino asitler konum yönlendirilmiş değiştirme yöntemi ile alanine çevrildi ve mutasyonların etkisi maya ikili-hibrid sistemi ile test edildi. AGPaz modelimizin ve burada tanımlanmış önemli-nokta amino asitlerin daha sonraki enzimin kararlı ve verimli formlarının geliştirilmesinde önemli olacağını düşünüyoruz.

In this thesis we modeled the native structure of ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) and identified important amino acids that take role in subunit-subunit interactions. AGPase is composed of pairs of large (LS) and small (SS) subunits. Although SS was crystallized in a homotetrameric form recently, structure of LS and native enzyme has not been revealed yet. In this study, we first modeled the structure of LS by homology modeling. Then, we proposed three models for AGPase based on the crystal structure of homotetrameric SS. Six dimeric interaction types between the subunits were extracted as the representatives of the proposed models. We performed molecular dynamics simulations of these dimers. Trajectories obtained from the simulations were analyzed by molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area (MM-PBSA) method to calculate the binding free energies of subunits. The two most favorable interaction types were used to construct the AGPase structure. Hot-spot residues that are critical for the subunit-subunit interactions were then identified by molecular mechanics generalized born surface area (MM-GBSA) method using free energy decomposition scheme. Importance of residues obtained from computational data was further experimentally verified. The residues were mutated to alanine by site directed mutagenesis and the effects of the mutations were assessed by yeast-two hybrid system. We believe that our AGPase model and the key residues defined here can be used as a guide for further studies that involve engineering a more stable and efficient form of the enzyme.