Structural and biochemical analysis of interaction of mCRY2 with mBMAL1

Abstract

Sirkadiyen ritimler bakterilerden memelilere kadar geniş bir kapsamdaki canlıların biyokimyasal, fizyolojik ve davranışsal düzenlemesini yaklaşık 24 saatlik periyotta düzenleyen döngülerdir. Kriptokromlar moleküler düzeyde sirkadiyen ritmi oluşturan transkripsiyon geri bildirim döngüsünde büyük öneme sahiptir. Kriptokrom alelleri hasara uğratılmış farelerin sirkadiyen ritimlerinin tamamen yok olması, kriptokromların sirkadiyen ritmlerin oluşması ve korunması için temel unsurlardan biri olduğunu ortaya koymuştur. Şu ana kadar ileri ve geri genetik teknikler kullanılarak sirkadiyen ritim'i değişik seviyelerde düzenleyen proteinler kısmi oranda tespit edilmiştir. Ancak transkripsiyonel mekanizmanın nasıl çalıştığı, BMAL1:CLOCK protein kompleksinin transkripsiyonel aktivitesinin nasıl durdurulduğu, Kriptokrom'un bu aktiviteyi nasıl durdurduğu gibi konular hala belirsizliğini korumaktadır.Bu çalışmada CRY2 proteininin PER2 ile etkileştiği bölgeler geri genetik yöntemler vasıtasıyla evrimsel olarak korunmuş R501 ve K503 bölgeleri olarak tespit edilmiştir. Bu bölgelerin mutasyona uğratılması PER2 ile etkileşimi ortadan kaldırıp CRY2'nin transkripsiyonel baskılama özelliğinin de yüksek oranda kaybolmasına yol açmıştır. Ayrıca bu bölgelerin mutasyona uğratılması, CRY2'nin BMAL1'e bağlanmasını engellememekte ve hücrenin çekirdeğine lokalize olmasını da etkilememektedir. Ayrıca CRY2'nin BMAL1'e bağlandığı bölge de yine geri genetik yöntemler vasıtasıyla tespit edilmiş olup proteinin N-ucundaki F171 bölgesine ve diğer bazı bölgelere atfedilmiştir.

Circadian rhythms are intrinsic periodic oscillations of physiological, biochemical and behavioral processes within approximately 24h periodicity in diverse species ranging from bacteria to mammals. CRYPTOCHROME proteins are one of the essential components of the mammalian circadian clock and null mutations of Cry leads to severe disruption of normal circadian clock function. Although forward and reverse genetic approaches have successfully unveiled the core and auxiliary circadian clock components in detail, the molecular mechanisms of the transcriptional repression in the circadian clock feedback loop remains elusive.In this thesis work, evidence will be provided through a reverse genetics approach that interaction of mCRY2 with mPER2 is mediated through evolutionary conserved amino acids on the C-terminus of mCRY2 (R501 and K503) and that interaction is essential for transcriptional repression of both endogenous and exogenous BMAL1:CLOCK heterodimer transcriptional activity. Moreover, it will be shown that mPER2 interaction is not a prerequisite for mCRY2 to bind to other circadian clock components, as ectopically expressed loss-of-function mutant immunoprecipitates with ectopically expressed mBMAL1. Furthermore, the functionality of the loss-of-function protein will be explored in terms of interaction with other core circadian clock proteins and nuclear localization pattern. It will be shown that loss-of-function is solely based on elimination of the interaction and not due to aberrant translocation of the mutant protein, as ectopically expressed tagged proteins can be detected immunocytochemically and also GFP-fusion constructs directly translocate into nucleus. In addition, the mBMAL1 interaction hot spots on mCRY2 are mapped to F171 on the N-terminus and other unresolved residues through another reverse genetics approach.