Advanced techniques for single molecule experiments and their applications

Abstract

Bu çalışmada, tek moleküllerin fulorasan özellikleri ve video-tabanlı izlenmesi zaman çözünürlüklü uzak alan optik algılama teknikleri kullanılarak incelenmiştir.Geniş alan mikroskopisi ve örnek taramalı eşodaklı agılama yapılabilen bir oda sıcaklığı düzeneği ile düşük sıcaklık deneyleri için düşünülmüş bir kriyostat düzeneği geliştirilmiştir. Mümkün olan ölçümler arasında zaman bilgili tek foton sayımı (TCSPC), fulorasan korelasyon spektroskopisi (FCS), fulorasan tayfların analizi, ve geniş alan- ve eşodaklı mikroskopileri yer almaktadır. Düzeneklerin doğru çalıştığı model sistemlerden alınan örnek verilerle doğrulanmıştır. Sonrasında, oda sıcaklığı düzeneği orjinal araştırma konuları için kullanılmıştır.İlk çalışma olarak iyi bilinen bir boya molekülü olan terilen nispeten az çalışılmış bir matris olan antrasin içine katkılanmış, ve eşodaklı agılama teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Terilenin fulorasan ömür süresi, moleküler yönelim, doygunluk algılama hızı, sistem arası geçiş hızı, ve fotostabilite özellikleri tek molekül düzeyinde incelenmiştir. Bu boya-matris eşlemesinin gelecekteki oda sıcalığı tek molekül deneyleri için ümit verici bir örnek olduğu gösterilmiştir.İkinci çalışma tek molekül izlemeyle ilgili olmuştur. Molekülün bir kare zamanı içindeki hareketini dikkate alan yeni bir görüntüleme modeli geliştirilmiştir. Bu genişletilmiş model gerçek veri oluşma işlemini daha iyi temsil etmiş, ve konum tahminlerinin doğruluğunu iyileştirmiştir. Bu model aynı zamanda moleküllerin hızlarının tek bir kareden tahmin edilebilmesini de mümkün kılmıştır. Konum ve hız verileri daha sonra bir Kalman filtresinde işlenerek molekülün izlediği yol çıkarılmıştır.Tezin son bölümü tek molekül deneylerinde sıklıkla kullanılan çığ fotodiyot algılayıcıların (APD) karakterizasyonunu içermiştir. Değişik marka ve/veya modellerdeki APDler dinamik aralık, karanlık sayı, doğrusallık, ve kararlılık yönünden karşılaştırılmıştır. Model devreler kullanılarak sinyal gürültü oranının sıcaklık ve ters gerilime bağlı değişimi incelenmiştir.

In this work, fluorescence properties and video-based tracking of single molecules were studied using time-resolved far field optical detection techniques.A room temperature setup with both wide-field microscopy and sample-scanning confocal detection systems, and a cryostat setup for low temperature experiments were developed. The range of possible measurements includes time correlated single photon counting (TCSPC), fluorescence correlation spectroscopy (FCS), analysis of fluorescence spectra, and wide-field- and confocal microscopies. Proper operation of the setups was verified by sample data acquired from model systems. The room temperature setup was then put into use to address original topics.As the first study, a well-known dye molecule terrylene was doped into a relatively unexplored host anthracene, and characterized using confocal detection techniques. Fluorescence lifetime, molecular orientation, detection rate at saturation, intersystem crossing rate, and photostability of terrylene were investigated on single molecule level. This dye-host combination was shown to be a promising sample for future room temperature single molecule experiments.The second study was about single molecule tracking. A new imaging model was developed that takes into account the motion of a molecule during the exposure time of a frame. This extended imaging model better represented the actual data generation process and improved the accuracy of position estimates. It also allowed molecules' velocity to be estimated from an individual frame. The position and velocity data were further processed in a Kalman filter to recover the trajectory of a single molecule.The last part of the thesis involved characterization of avalanche photodiode detectors (APD), which are commonly used in single molecule experiments. APDs with different brands and/or manufacturers were compared in terms of their dynamic range, dark count rate, linearity, and stability. Evaluation boards were used to study signal to noise ratio as functions of temperature and bias voltage.