Structure function relationship of plant ADP-glucose pyrophosphorylase

Abstract

Nişasta, bitkilerin temel depo polisakkariti olup hem insanların temel besin maddelerinden biri olarak hem de birçok endüstriyel uygulamada ham madde olarak kullanılmaktadır. ADP glikoz pirofosforilaz (AGPaz), giderek artan dünya nüfusunun besin ve endüstriyel ihtiyaçlarını karşılayabilmek amacıyla bitkilerin nişasta verimini artırmak için üzerinde yoğun çalışmalar yapılan enzimlerden biridir. AGPaz, bakterilerde glikojen ve bitkilerde nişasta sentezinin ilk adımını katalizleyerek allosterik düzenlemeye tabii yapısı ile karbon akışını kontrol eden enzimdir. Bitkilerdeki AGPaz, iki tane büyük (LS) ve iki tane küçük (SS) alt birimin bir araya gelmesinden oluşan heterotetramerik bir enzim olup doğru bir şekilde çalışabilmesi ve regüle edilebilmesi için her iki alt birimine de ihtiyaç duyan bir enzimdir. Bitkilerde nişasta verimini artırmak üzere AGPaz aktivitesini iyileştirmek için enzimin yapı-işlev ilişkisi ile ilgili çalışmalar dikkat çekmektedir. Bu doktora tezi AGPaz enziminin iki ana özelliğini ele almaktadır. Birincisi, uzun gün bitkisi olan mercimekte (Lens cullinaris, Medic.) AGPaz izoformlarinin gün uzunluğu ve enzimin transkripsiyonel regülasyonu arasındaki ilişkiyi incelemektir. Nişasta sentezi ve yıkımının gündüz ve gece süresine bağlı olarak sıkı bir şekilde düzenlendiği bilinmektedir. Bu tez çalışmasında, mercimeğin AGPaz izoformlarinin uzun gün ve kısa gün koşulları altındaki transkripsiyon seviyesindeki değişimler incelenmiştir. Bunun için mercimek AGPaz'ına ait olan iki tane LS iki tane SS izoformunun cDNA'ları izole edilmiştir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile ifade analizi yapılan mercimek AGPaz izoformlarinin uzun gün ve kısa gün koşulları altında farklı olduğu belirlenmiştir. Bu farklı transkripsiyon profili, bizi farklı foto-periyot koşullarında enzimin kinetik özelliklerini incelemeye yöneltmiştir. Bu tezin ikinci olarak ele aldığı konu AGPaz'ın heterotetramerik olarak bir araya gelişini iyileştirmek ve dolayısıyla daha kararlı AGPaz çeşitleri elde etmek amacıyla patates AGPaz'ının alt birimleri arasındaki ilişkiyi incelemektir. Hesaplamalı ve deneysel çalışmalar AGPaz enziminin heterotetramer oluşturmasının termodinamik olarak zayıf olduğunu göstermektedir. Alt birimleri arası ilişkiyi güçlendirmek ve yeni AGPaz varyantları elde etmek için patates AGPaz'ının büyük alt birimi üzerinde rastgele ve bölge-hedefli mutajenez yöntemleri uygulanmıştır. Ters genetik yaklaşımı ile patates AGPaz'ının heterotetramer oluşumu iyileştirmek için, heterotetramer oluşumunu engelleyen R88A mutasyonunu taşıyan LS cDNA'sı üzerinde hata meyilli PCR yapılarak AGPazı eksik bakteri hücre hattında yapılan iyot boyama tekniği ile heterotetramer oluşturma özelliğini dolayısıyla glikojen sentezini geri kazandıran mutasyonları taşıyan AGPaz'lar seçilmiştir. Yeni elde edilen mutant AGPaz'lar doğal poliakrilamid jel elektroforezi, saflaştırma ve enzimatik analizler gibi biyokimyasal yöntemlerle karakterize edilmiştir. Sonuç olarak, LS üzerinde SS ile yabanıl tipe kıyasla daha güçlü etkileşmesini sağlayan spesifik amino asitler tespit edilmiştir. Bir sonraki amaç olarak bulunan yeni AGPaz'ların fizyolojik etkilerini transgenik çeltik bitkilerinde incelemek hedeflenmiştir. İlk olarak, rekombinant AGPaz'ların enzimatik ve yapısal özelliklerini analiz etmek üzere çeltik endosperm AGPaz LS'i üzerindeki eş bölgelerde patates AGPaz LS'i üzerinde bulunan mutasyonlar yapıldı. Daha sonra Agrobakteri aracılığıyla çeltik tranformasyonunu yapabilmek için çeltik endosperm AGPaz mutant LS'lerini taşıyan bitki ifade vektörleri hazırlandı. Birinci nesil transgenik bitkiler başarı ile elde edildi. Kararlı ve homozigot transgenik çeltik bitkilerinin elde edildikten sonra nişasta miktarı ve AGPaz aktiviteleri gelecek çalışmalarda araştırılacaktır.

Starch is the main storage polysaccharide of plants. It constitutes not only the majority of the human diet but also is used in many industrial applications. There have been significant efforts to increase the starch yield of plants in order to meet the nutritional and industrial requirements of a growing population. ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase) is one of the target enzymes of many research studies focusing on the improvement of the starch yield in crop plants. AGPase catalyzes first committed step of bacterial glycogen and plant starch synthesis as it controls carbon flux via its allosteric regulatory behavior. Plant AGPase is a heterotetrameric enzyme (α2β2), composed of two identical large (LS) and two identical small (SS) subunits, which requires both subunits for proper functioning and regulation. Structure-function relationship of AGPase gets much of the attention in order to modulate its activity to increase starch yield of plants. This PhD thesis is focused on two main aspects of AGPase. The first one is exploring the correlation between day length and transcriptional regulation of AGPase isoforms in long day plant lentil (Lens culinaris, Medic.). It is known that starch synthesis and degradation are strictly regulated according to day and night-time. In this thesis, transcriptional regulation of AGPase isoforms in lentil leaf and stem under long and short photoperiod was elucidated. To this end, lentil AGPase cDNAs belonging to two isoforms of LS and two isoforms of SS were isolated. Expression profiles of lentil AGPase isoforms, which were analyzed by quantitative real time PCR, were found to be distinct in long-day and short-day grown plants. The distinctive transcriptional profiles led us to explore kinetic properties of the plant exposed to different photoperiod conditions. The second aspect of this thesis is to study subunit-subunit interaction of potato AGPase in order to enhance heterotetrameric assembly thus, in turn, to generate more stable AGPase variants. Computational and experimental studies indicate that heterotetrameric assembly of AGPase is thermodynamically weak. To modulate the subunit-subunit interaction and to find novel variants of AGPase, random mutagenesis and site directed mutagenesis techniques were applied to the LS of potato tuber AGPase. By using reverse genetics approach we improved heterotetrameric assembly of potato AGPase by subjecting LS-R88A cDNA to error-prone PCR, and selecting second-site revertants according to their ability to restore glycogen accumulation, as assessed by iodine staining, in bacterial cells lacking their own AGPase. Novel mutants of AGPase were characterized by biochemical techniques including native polyacrylamide gel electrophoresis, purification and enzymatic assays. As a result, specific amino acids on the LS which interact with the SS stronger than wild-type LS were identified. The next objective was to analyze physiological effects of novel AGPases in transgenic rice plants. First, identical replacements of the residues found on the LS of potato AGPase have been generated in the LS of rice endosperm (OsAGPL2) in order to analyze in vitro enzymatic and structural properties of recombinant AGPases. Then, plant expression vectors carrying mutant LSs of rice endosperm AGPase were constructed for Agrobacterium mediated transformation of rice. First generation of transgenic plants was obtained successfully. In future, stable homozygous lines of transgenic rice plants will be analyzed for their starch content and AGPase activity.