A genetic approach to reveal determinants of mitochondrial tail-anchored protein targeting

Abstract

Tail-anchored (TA) proteinleri fosfo-lipit zara karboksil ucundaki tek transmembran bölge (TMD) aracılığı ile bağlanan, hücre membranına entegre olan proteinlerin familyasına ait proteinlerdendir. TA proteinleri, proteinlerin organellerin içine alınmasını sağlamaları, mitokondriyal dinamik fonksiyonlarında faaliyet göstermeleri ve hücrelerin kendilerini öldürmelerinde rol almaları gibi birçok önemli görevi yerine getirirler. TA proteinlerinin endoplazmik retikulum ve perokslzom zarlarına nasıl entegre oldukları bilinmesine rağmen, bu proteinlerin mitokondriye nasıl ulaştıkları ve ne şekilde mitokondrinin dış zarına entegre oldukları hala gizemini korumaktadır. Bu çalışmada, tek hücreli ökaryot Saccharomyces cerevisiae model organizmasını kullanarak ve seçici koşullar altında fonksiyonu yaşam için gerekli olan kimerik bir proteinin kullanildigi genetik bir teknikten yararlanarak, TA proteinlerinin mitokondriye ulaşmalarını ve entegre olmalarını sağlayan özellikleri bulmayı amaçladık. Yeni nesil sekanslama adı verilen DNA sekanslama yöntemini bizim genetik tekniğimizle birleştirerek, Saccharomyces cerevisiae Fis1 proteininin mitokondriye entegre olmasını sağlayan TMD adı verilen bölgenin, yapısal ve dizisel özelliklerini gösterdik. Gal4 transkripsiyon faktörüne bağlı Fis1p TA varyantlarını içeren kütüphaneyi elde ettikten sonra, çekirdekte Gal4 aktivitesine izin veren mutasyonlari seçtik. Yeni nesil sekanlama yardimi ile seçilimden önce ve sonra TA lokalizasyonu etkilenen varyantlarin miktarini belirledik. Bu geniş çapli analizin sonuçlari önemli olan her bir Fis1 TA varyantında tekrarlandi. Sonuçlarımız, ilginç bir şekilde, pozitif yüklü aminoasitlerin TMD bölgesi içerisinde negatif yüklü aminoasitlere göre daha töleranslı bir şekilde bulunabildiklerini gösterdi. Bunlara ek olarak, TMD bölgesinin uzunluğunun TA proteinlerinin mitokondriye yönlendirilmelerinde bir etkisi olmadığını ve TMD bölgesinin heliks yapısını bozan prolinin TMD içinde kabul edilmediğini gösterdik. Son olarak da, TMD bölgesinin uç kısımlarında bulunan pozitif yüklü aminoasitlerin, TA proteinlerinin özellikle mitokondriye yönlendirilmeleri için önemli olduklarını; fakat herhangi bir organel zarina entegre olmalarına katkıda bulunmadıklarını ortaya çıkardık. Bildiğimiz kadarıyla bu çalışma derin mutasyon incelemesi yapan bir tekniği, ökaryotlara ait organel sinyal sekansını analiz etmek amaçlı kullanan ilk çalışmadır.

Tail-anchored (TA) proteins are a group of integral membrane proteins anchored to the phospholipid bilayer by a carboxyl-terminal single transmembrane domain. TA proteins carry out a wide range of crucial functions, such as taking a role in protein translocation, mitochondrial dynamics, storage of transcription factors and regulation of apoptosis. Although how the ER and peroxisomal tail-anchored proteins are targeted to their corresponding membranes were elucidated, targeting of mitochondrial TA proteins to the outer membrane of mitochondria remains its mystery. In this study, we aimed to reveal the determinants of the mitochondrial TA protein targeting, using the organism Saccharomyces cerevisiae. We developed a genetic approach which is based on viability, following mislocalization of a chimeric protein whose function is necessary for survival under selective conditions. By coupling our genetic selection approach to next-generation sequencing, we revealed the structural and sequence characteristics essential for targeting of Saccharomyces cerevisiae Fis1p, a protein inserted into the outer membrane of mitochondria by a TA. We generated a library of Fis1p TA variants linked to the Gal4 transcription factor, then selected for mutations allowing Gal4 activity in the nucleus. We quantified TA variants in our mutant library both before and after selection for diminished TA targeting. Large-scale analysis results were recapitulated by further analysis of individual Fis1 TA constructs. We demonstrated that positively charged amino acids are more tolerated within the TA of Fis1p than negatively charged residues and they do not interfere with insertion and functionality of Fis1p. These findings present solid, in vivo evidence that arginine and lysine can ''snorkel'' by stably associating with a lipid bilayer and placing their terminal positively charged head group to water-lipid bilayer interface region. Moreover, our results exhibited that length of the TA of Fis1p does not influence targeting to mitochondria and proline is not tolerated at many positions within the TA of Fis1p due to its helix-disrupting feature. Finally, we revealed that positively charged amino acids found at the carboxyl terminus of the TA are crucial for specific targeting to mitochondria; however, not necessary for membrane localization. This dissertation serves the first high-resolution analysis of a eukaryotic organelle targeting sequence by deep mutational scanning.