The role of chromatin modifying enzymes in fibroblast-to-hepatocyte direct lineage conversion

Abstract

Transdiferensiyasyon, farklılaşmış bir hücrenin başka bir hücre türüne ait transkripsiyon faktörlerinin ifade edilmesini sağlayarak o hücre türüne dönüşmesini sağlama metodudur. Bu metot, farklılaşmış hücrelerin uyarılmış pluripotent kök hücrelere (UPKH) yeniden programlanmasıyla karşılaştırıldığında daha hızlı ve klinik uygulamalarda kullanmak için daha güvenlidir. Ancak, başka bir hücre tipine dönüşen hücrelerin yüzdesi azdır ve potansiyel terapi tedavilerinde kullanmak için bu metodun veriminin arttırılması gerekmektedir. Yeniden programlamada hücrelerin epigenetik durumlarının geniş çaplı bir değişime uğraması gerekir ve kromatin değiştiricileri UPKH oluşumunda önemli rol oynar. Bu çalışmadaki ana hipotezimiz, kromatin değiştiricilerinin transdiferensiyasyonda da önemli role sahip olduklarıdır. Kromatin modifikasyonlarını sağlayan enzimlerin insan deri hücrelerinden karaciğer hücrelerine transdiferensiyasyonundaki rolünü inceleyebilmek için FOXA3, HNF1A ve HNF4A transkripsiyon faktörleri kullanıldı. Hücrelerin dönüşüm yüzdelerini belirlemek için lentiviral bir Albumin – GFP habercisi oluşturuldu. Bu sistem ile CRISPR/CAS ile genomdan silinen veya kimyasal ile inhibe edilen H3K79 metiltransferazı DOT1L'in erken aşamalarda karaciğer hücrelerine direkt dönüşümü arttırdığı gözlemlendi. DOT1L'in inhibisyonu hepatosit genlerinin ifadelerini hızlandırdığını ve fibroblast hücrelerine ait genlerin ifadelerini azalttığını belirlendi. Ayrıca, DOT1L'in inhibasyonun Albumin'in hücre dışına salgılanmasını arttırdığı gözlemlendi. Oluşan hücrelerin hepatosit fonksiyonlarından biri olan glikojen depolayabildiğini gösterildi. Son olarak, oluşturduğumuz Albumin habercisi ile kromatin yazıcı, silici ve okuyucusunu hedefleyen küçük moleküllerin dönüşümün 6, 9 ve 12. günlerde Albumin ifade eden hücre oranlarına etkisini incelendi. Bu moleküllerden Rocilinostat, SAHA, GSK8815, MS023, Valproic Acid, GSK8814, LP99 ve IOX2'in erken aşamalarda transdiferensiyasyon verimini arttırdığını, ayrıca 3-DZNEP, Repsox ve CHR-6494 moleküllerinin ise sonraki aşamalarda bir rolünün olabileceğini gözlemlendi. Bu çalışmanın sonuçları kromatin modifikasyonunda görevli enzimlerin transdiferensiyasyonda nasıl rol aldıklarını ve terapi amaçla kullanılabilecek yapay hepatositlerin nasıl daha verimli elde edilebileceğini göstermektedir.

Transdifferentiation is a reprogramming method to directly convert a differentiated cell into another differentiated cell type by overexpressing lineage-specific transcription factors. Compared to reprogramming of differentiated cells into induced pluripotent stem cells (iPSC), it is faster and potentially safer for clinical applications. However, the efficiency of lineage conversion remains low and needs to be improved for potential therapeutic applications. Reprogramming requires extensive remodeling of cellular epigenetic states, and chromatin modifiers have emerged as important regulators of iPSC generation. We hypothesized that such regulators may also play crucial roles in direct lineage conversion. To investigate the role of chromatin modifiers in transdifferentiation, we utilized an established protocol of direct conversion of human fibroblasts to induced hepatocytes (iHep) via overexpression of FOXA3, HNF1A and HNF4A. A lentiviral GFP-reporter for Albumin expression was generated to monitor conversion efficiency. Using this system, we observed that CRISPR/CAS mediated knockout and chemical inhibition of the H3K79 methyltransferase DOT1L increases direct conversion to hepatocytes at early time points. Dot1L inhibition accelerated the induction of hepatic markers and silencing of the fibroblast markers. In addition, we observed Albumin secretion is increased with the loss of DOT1L. Moreover, iHeps obtained through Dot1L inhibition displayed basic hepatic functions such as glycogen storage. Encouraged by these results, we performed a compound screen that targets a broad range of chromatin writers, erasers and readers. Using the albumin reporter, we identified compounds that increases transdifferentiation efficiency at day 6, day 9 and day 12 after the overexpression of required transcription factors. Among these Rocilinostat, SAHA, GSK8815, MS023, Valproic Acid, GSK8814, LP99 and IOX2 can increase transdifferentiation efficiency at early stages, while 3-DZNEP, Repsox and CHR-6494 have a role in later stages. These results provide important insights into how chromatin modifiers and epigenetic modifications affect transdifferentiation and may contribute to new strategies of obtaining iHeps with higher efficiencies for potential therapeutic applications.